WUSTL - Sequenze di DNA ripetute e malattie

Fondazione FONAMA

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Traduzione di Natale Marzari

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Traduzione del 20 febbraio 2011

SEQUENZE DI DNA RIPETUTE e MALATTIE

Principi generali
Ripetizioni nel genoma umano
Tipi di ripetizioni
Ripetizioni trinucleotidiche
Generale
Associazioni a malattie
Tipi di ripetizioni
    Tipo 1: Esoniche
      _p(CAG)_n: Glutamina
      _p(GCG)_n: Alanina
    Tipo 2: Regioni non traslate
      5': _p(CCG)_n
      3': _p(CTG)_n
    Tipo 3: Introniche
      _p(AAG)_n
Disturbi con altri numeri di ripetizioni
Disturbi muscolari

Sequenze ripetute: Principi generali ¹

Sequenze ripetute nel genoma umano
- Nucleotidi: Adenina; Timina; Guanina; Citosina
- Il genoma contiene molte sequenze di DNA ripetute
- Alcune sequenze ripetute hanno una frequenza maggiore nei primati
- La lunghezza delle sequenze ripetute: Varia da 1 nucleotide all'intero gene
  - In alcune regioni non traslate si trova DNA altamente ripetitivo
    - Una sequenza 6 ÷ 10 paia di basi può essere ripetuta 100.000 ÷ 1.000,000 volte
  - Un intero gene può esistere come gruppi tandem di molteplici copie (50 ÷ 10.000)
    - Le molteplici copie dei geni includono istoni, RNA ribosomale, tRNA, SMN
    - ? Permettere l'accumulo di una maggior quantità di prodotto del gene per unità di tempo
    - Va incontro all'alto fabbisogno biosintetico durante lo sviluppo iniziale
    - Silenziamento del gene indotto dalla ripetizione: Via metilazione e compattamento della cromatina
      - Al locus 1 copia del gene viene espressa più efficacemente che
        molte copie in serie
      - Maggior repressione in caso di molte copie di un gene su 1 cromosoma che con dispersione su numerosi cromosomi
- Alcune ripetizioni di DNA sono presenti in numerosi posti e geni nel genoma
- Alcune ripetizioni di DNA sono mutazioni "punto caldo"
  - A causa di errori durante la duplicazione del DNA, per es. Alu
  - Formano fragili punti di rottura cromosomica, per es. ripetizioni CCG
  - Il numero delle ripetizioni può essere instabile durante la duplicazione del DNA, per es. ripetizioni CAG
Tipi di ripetizioni del DNA: DNA ripetuto in tandem e ripetizioni del DNA sparpagliate
- DNA ripetuto in tandem
  - Ripetizioni spesso associata con sindromi di malattie
  - Telomeri
    - Contengono lunghe serie di ripetizioni TTAGGG
    - Le ripetizioni formano un complesso di nucleoproteine: Associate con le proteine TERF
    - Funzione ripetuta
      - Protezione del terminale del cromosoma
      - Replicazione del terminale del cromosoma
      - Controllo della lunghezza del telomero
- Ripetizioni del DNA sparpagliate
  - Elementi nucleari brevi sparpagliati (SINE)
    - Alu
      - Ricchi di GC
      - Lunghezza: ~ 280 paia di basi
      - Localizzazione: Regioni introniche non traslate
      - Specie: Specifica dei primati
      - Metilazione: Materna
      - Funzione: ?
      - Polimorfismo nella: Distrofia miotonica con ripetizioni CTG
      - Mutazioni coinvolgenti elementi Alu: Pazienti occasionali
        
        CCFDN: Identificata una sola mutazione
        
        LGMD 2A
        
        Ritardo mentale con epilessia, ingrandimento del ventricolo rostrale
        
        Polimorfismo ACE
        Cardiomiopatia correlata alla distrofina
    - Elementi Mariner (Simili a Mariner)
      - Fiancheggiati ai lati da dinucleotidi TA
      - Lunghezza: ~80 bp
      - Struttura della sequenza
        
        2 sequenze ripetute invertite perfettamente di 37 paia di basi
        
        Separate da sei paia di basi uniche (GAAAGT)
      - ? correlati alla produzione delle mutazioni nella CMT 1A
  - Elementi nucleari lunghi sparpagliati (LINE)
    - Elemento L1 (Ripetizione Kpn)
    - Regioni ricche di AT
    - Lunghezza: 6÷8 kb
    - I LINE contengono promotori interni per la RNA polimerasi III
    - Metilazione: Paterna
    - Specie: Mammiferi
  - Elementi trasponibili con lunghe ripetizioni terminali
    - Lunghezza: 1,5 ÷ 10 kbp
    - Codifica la trascriptasi inversa
    - Fiancheggiati da ripetizioni terminali di 300 ÷ 1000 bps
    - Regolazione
      - Metilazione: Paterna
      - Strutture repressive della cromatina
    - Comprendono un retrovirus endogeno umano non funzionale (hERV)
  - Trasposoni di DNA
    - Fase di lettura aperta senza un singolo introne
    - Codifica la trasposasi
    - Due brevi sequenze ripetute invertite fiancheggianti la fase di lettura
- Elementi di ripetizione trasponibili: Possibili effetti collaterali
  - Mutagenesi inserzionale diretta
    - ~1 ogni 500 nuove mutazioni nella linea germinale 2" a elementi trasponibili
  - Ricombinazione tra ripetizioni non alleliche
    - Possono causare traslocazioni e altri riarrangiamenti
    - Vedi CMT 1A
  - Presenza di regioni promotrici forti
    - Possono causare produzione di proteine inappropriate
  - Produzione anti senso
  - Dimetilazione nei tumori
    - Disfunzione nell'attività dei trasposoni
    - ? Inappropriate espressioni del gene
    - ? Aumento della funzione oncogena
  - Inseriti dentro i geni
    - Effetto: Riduzione della funzione
    - Vedi Distrofia muscolare congenita di Fukuyama
Ripetizioni trinucleotidiche
- 10 possibili sequenze di motivi
- Ulteriori variazioni funzionali dipendendo dalle fase di lettura
- Nomenclatura:
  - Le stesse ripetizioni nucleotidiche possono essere scritte in differenti modi
    - CCG, CGG, GCC sono identiche
    - AGC, CAG sono identiche
  - Ripetizione AGC nell'esone in fase di lettura: Traslata dal CAG a poliglutamina

Sequenze ripetute: Associazioni con malattie

Ripetizioni trinucleotidiche: Correlazioni con malattie
- Dimensioni delle ripetizioni
  - Normali: Gamma polimorfica dentro una gamma di dimensioni definita "solita"
    - La duplicazione del DNA può cambiare le dimensioni della ripetizione entro la gamma normale, ma raramente fuori della solita gamma
  - Intermedie
    - Clinica: Nessuna caratteristica clinica
    - Genetica
      - Gamma delle"premutazioni"
      - Può predisporre a mutazioni in una grande gamma correlata a malattie
  - Marginalmente: Può produrre sindromi di malattie con
    - Penetranza ridotta (Huntington)
    - Ereditarietà recessiva (OPMD)
  - Mutazione grande "piena"
    - Solitamente associata con espressione di malattia
    - Può essere stabile o predisporre ad ulteriore espansione o contrazione delle mutazioni
  - Se le ripetizioni non vengono traslate dentro le proteine
    - Maggiore gamma del normale dello stato di malattia e più ripetizioni
- Carattere delle ripetizioni
  - Normali
    - Solitamente leggere variazioni dentro la sequenza delle ripetizioni
    - Contiene interruzioni (variazioni nei nucleotidi) dentro le ripetizioni
  - Mutanti
    - Più grandi della gamma normale
    - Spesso sequenza delle ripetizioni più perfetta
    - Sequenze di ripetizioni mutanti (Grandi) non perfette: SCA 3 e Huntington
- Processo mutazionale: Aumento del numero di copie delle ripetizioni
  - Spesso più probabilmente se la sequenza delle ripetizioni è perfetta
  - Mutazione iniziale
    - ? perdita delle interruzioni portante a ripetizione perfetta
    - La premutazione ripete le dimensioni nella gamma intermedia
  - Può essere affetto da polimorfismo alla fine 3' della ripetizione CAG negli alleli normali
    - Instabilità intergenerazionale : > con GGG che con CGG (nella SCA 3)
  - Maggiormente preminente negli umani che nei sub-primati
  - Topo transgenico
    - Huntington: Età paterna più alta ® maggiori probabilità di espansione CAG
    - SCA1: Età materna più alta ® maggiore frequenza dell'instabilità e delle dimensioni della CAG
- Ripetizioni trinucleotidiche con associazioni a malattia: CCG; CAG; AAG; CTG; GCG
- Bias genitoriale
  - X fragile di tipo A
    - Piena mutazione solamente dopo la trasmissione materna della ripetizione
  - Distrofia miotonica
    - Trasmissione femminile: Dimensioni della ripetizione illimitate
    - Trasmissione Maschile: Le grandi ripetizioni tendono a regredire nelle dimensioni
  - Ripetizioni CAG
    - Ereditarietà paterna: Ripetizioni più grandi e insorgenza della malattia più precoce

Tipi di trinucleotidi (e di altre lunghezze) e disturbi da ripetizione

	Ripetizioni traslate dentro la proteina
	Si	No
Ripetizioni nucleotidiche	CAG; GCG; Altre	AAG; CAG; CCG; Altre
Livello di instabilità	Moderato	Alto
Mutazione della lunghezza	Moderata (< 100)	Lunga (100 ÷ 2,000)
Patologia	Neuroni specifici	Multisistemica
Meccanismo postulato della malattia	Proteina: Inizio della funzione tossica	Espressioni alterate: Proteina o RNA Le proteine legano alla ripetizione nucleotidica
Disturbi	Neuronopatia bulbospinale SCA 1, 2, 3, 6, 7 e 17 OPMD; FSP2; DRPLA Huntington 1 e 2	Mioclone del baltico Siti di cromosoma fragili Atassia di Friedreich Atassia, tremore e declino cognitivo Distrofia miotonica : 1; 2 SCA: 8; 10; 12

Ripetizioni _p(CCG)_n
- Frequenza: Non insolite nel genoma umano
- Localizzazione: Solitamente nelle regioni 5' non traslate dei geni
- Dimensioni delle ripetizioni
  - Normali: Gamma polimorfica (25 ÷ 55)
  - Grandi: Mutazione piena (> ~230)
- Mutazione grande: Meccanismi della malattia
  - Cromosoma vicino al sito suscettibile di rottura
  - Può inattivare il gene: ?Inibisce la trascrizione del gene
    - Ripetizioni espanse
    - Metilazione della citosina della mutazione e degli adiacenti residui CpG
    - ? Interazione della proteina legante a CGG con ripetizione delle sequenze espanse delle
- Malattie
  - Sindrome del X fragile
  - Atassia con tremore e declino cognitivo
  - X fragile, Acido folico di tipo (FRAXE)
- Ereditarietà: Collegata a X o dominante

Ripetizioni _p(CAG)_n

Localizzazione
- In esoni dei geni in tutto il genoma
- ? Ad eccezione di SCA12
Aminoacido codificante: Glutamina
Dimensioni delle ripetizioni
- Normali: Limite superiore 32 ÷ 40
- Grandi: Limite inferiore 32 ÷ 62
- Ad eccezion del SCA6: Normale 4 ÷ 18; Grande 21 ÷ 30
- Malattie a penetranza ridotta: HD 36 ÷ 41 ripetizioni; SCA2 32 ÷ 34 ripetizioni
- Alleli intermedi: Dimensioni di CAG
  - Dalle quali sorgono nuove mutazioni
  - > del solito nella popolazione generale, < che nei pazienti con la malattia
  - Trovate clinicamente in alcune persone normali
  - Huntington: 29 ÷ 35 ripetizioni
- Gamma delle dimensioni: Normali vs malattia
  - Gamma normale e malattia mutualmente esclusive: SBMA; SCA 3, 6 e 7; DRPLA
  - Nessuna interruzione tra gamma normale e di malattia: Huntington; SCA1 e 2
Ripetizione CAG correlate a malattia e interruzioni nelle sequenze CAG

Malattia	Proteina	Localizzazione della proteina	Ripetizioni normali/ malattia	Sequenza CAG normale	Sequenza CAG in malattia	Aggregati
Huntington (HD)	Huntingtina	Citoplasma	6÷35/ 38÷180	Interruzione Penultima CAA	Interruzione Penultima CAA	Nucleari
Huntington 2 (HDL2)	Junctophilin-3	Membrane	6÷27/ 35÷57	?	CAG pura	?
SCA1	Atassina-1	Nuclei	6÷39/ 40÷88	Interruzione 1÷3 CAT	CAG pura	Nucleari
SCA2	Atassina-2	Citoplasma	14÷32/ 33÷77	Interruzione CAA	CAG pura	Citoplasmatici
SCA3	Atassina-3	Nuclei	12÷40/ 55÷86	Interruzione 1 GGG o CGG	Interruzione 1 CGG (90%)	Nucleari
SCA6	Canale P/Q Ca ⁺⁺	Membrane	4÷18/ 21÷31	?	?	Nessuno
SCA7	Atassina-7	Nuclei	7÷17/ 34÷200	?	?	Nucleari
SCA12	PPP2R2B		7÷32/ 55÷93	?	CAG pura	?
SCA 17	Proteina legante a TATA	Nuclei	25÷42/ 45÷63	Interruzione CAA	Interruzione CAA	Nucleari
SBMA	Recettore degli androgeni	Nuclei Citoplasma	9÷36/ 38÷65	CAG pura	CAG pura	Nucleari
DRPLA	Atrophin-1	Citoplasma	3÷36/ 49÷88	CAG pura	CAG pura	Nucleari
Schizofrenia	KCNN3	Membrane	12÷28/sovra rappresentanza di alleli lunghi
Infertilità maschile	POLG1	Mitocondri	10/0

Ereditarietà dei disturbi: Dominante
- Eccezione: La SBMA è collegata a X recessiva
Anticipazione: Materna > paterna
Possibili effetti delle ripetizioni CAG extra (modelli di malattia Huntington e SCA-1):
"Inizio della funzione tossica" - La proteina mutata con grandi sequenze delle ripetizioni glutamato diventa tossica
- Ripetizioni di poliglutamina di lunghezza extra ® traslate dentro la proteina
- La proteina espansa va incontro a cambiamenti conformazionali
  - ? Auto aggregazione dei siti nella striscia di poliglutamina
    - Formazione di forcine via legami idrogeno anti-paralleli
    - "Zip polari"
- La proteina espansa è più suscettibile al distacco proteolitico
- Frammenti della proteina degradata trasportati al nucleo
  - Degradazione via caspasi 3 e altri enzimi
  - Il terminale N viene trasportato al nucleo e lega alla matrice nucleare
  - Degradazione della proteina mutante a frammenti più brevi ® Trasporto al nucleo più abbondante
    - L'atassina 1 espansa si lega alle proteine nucleari acide ricche di leucina (LANP):
      ? Spiega la vulnerabilità cellulare selettiva
- Formazione di aggregati
  - Frammento della proteina nel nucleo ® Forma da nido per una maggiore aggregazione delle molecole
  - Gli aggregati includono
    - Ubiquitina
    - Componenti del proteasoma (20S)
    - Chaperoni HDJ-2/HDSJ (Famiglia del Hsp40)
  - ? L'aggregazione coinvolge reazioni di transglutaminasi
    - Ridotte da
      - Inibitori della transglutaminasi: Cistamina e cadaverina monodansile
      - Sovraespressione dei chaperoni HDJ-2/HDSJ
  - L'aggregazione ha una forma a pieghe
  - L'aggregato viene "solidificato" dalla ubiquitinazione
  - Le cellule con aggregati nucleari più sono suscettibili all'apoptosi
  - Aggregati simili possono formarsi nel citoplasma e causare neurite distrofica
  - Eventi simili quando la poliglutamina viene espressa in proteine normalmente non patogene
- ? Inclusioni nucleari correlate alla malattia
  - Pro
    - Presenti prima del fenotipo della malattia
    - Spesso localizzate nelle regioni della malattia
    - Espressione nucleare della proteina poliglutamato implicata nella patogenesi della malattia
  - Contro
    - Scarsa correlazione tra la morte neuronale e l'abbondanza delle inclusioni
    - Alcune malattie senza inclusioni nucleari: SCA2 e SCA6
Minori ripetizioni CAG
- Cancro della prostata: < 18 nel recettore degli androgeni
  - Aumento della frequenza, specialmente in giovane età
  - Estensione extraprostatica, metastasi distanti, o alta grado istologico
Ripetizioni CAG extra senza malattia (Polimorfismi)
- ERDA1 : Cromosoma 17q21.3
  - Frequenza di grandi ripetizioni CAG (gt; 40): Comuni negli asiatici; Meno comuni negli africani
  - La ripetizione della lunghezza cambia con la trasmissione
    - Ridotta nella paterna
    - Aumentata nella materna
  - Grande dimensioni della ripetizione
    - Tasso mutazionale aumentato
    - Nessun cambiamento nelle dimensioni dell'alterazione
- SEF2-1 : Cromosoma 18q21.1

Ripetizioni _p(CTG)_n
- Localizzazione: Regione 3' non traslata
- Dimensioni delle ripetizioni
  - Normale: 5 ÷ 35 copie
  - Gamma intermedia: 35 ÷ 50
  - Affetti leggermente: 50 ÷ 80
  - Gravemente affetti: Fino a 4.000 copie
- Malattie: Distrofia miotonica; ? SCA8
- Ereditarietà: Dominante
- Meccanismi di malattia postulati
  - ? effetto su RNA stabilità o processi
  - Proteina legante a grandi ripetizioni trinucleotidiche
  - Espressione alterata da DNA fiancheggianti dentro la proteina (DMAHP)
Ripetizioni_p(GCG)_n ⁶
- Composizione nucleotidica delle ripetizioni
  - Imperfetta
  - Triplette GCN: Sopra-rappresentazione delle triplette GCG
- Localizzazione: Esone
- Aminoacido codificante: Alanina
- Stabile durante meiosi e mitosi
- Proteine normali: Ripetizioni polialaniniche
  - Frequenti nelle cellule eucariotiche: Particolarmente comuni nei fattori di trascrizione
  - Scarsamente conservate nei vertebrati
  - Comunemente localizzate
    - All'esterno di altri domini funzionali
    - Fine del terminale N delle proteine
- Malattie: Disturbi da ripetizioni polialaniniche
  - Generale
    - Tipi di malattie: Malformazioni congenite
      - Specialmente disturbi scheletrici e del sistema nervoso
    - Proteina
      - Funzioni: Tutte geni dei fattore di trascrizione, eccetto la OPMD
      - Mutante: Presente; Stabile
    - Età dell'insorgenza: Giovani, eccetto la OPMD
    - Comparazione con altri tipi di mutazione nello stesso gene
      - Tende a produrre disturbi più lievi
      - Può non produrre le stesse manifestazioni di malattia
    - Sequenze ripetute più lunghe: Alcuni disturbi più gravi
    - Ereditarietà
      - Dominante: Solito
      - Recessive: Sindrome degli spasmi infantili
      - Effetto dosaggio: Omozigotici più gravi degli eterozigotici
    - Meccanismo della mutazione: Ricombinazione ineguale di alleli omologhi
    - Meccanismo della malattia
      - Inizio della funzione tossica
      - Aggregazione delle proteine: Citosol o nuclei
  - Distrofia muscolare oculofaringea (OPMD)
    - Dimensioni delle ripetizioni (OPMD)
      - Normale: 6 ripetizioni
      - OPMD recessiva: 7 ripetizioni omozigotiche
      - OPMD dominante: 8 ÷ 13 ripetizioni
  - Disturbi nervosi
    - Sindrome della ipoventilazione congenita (CCHS) : Omeobox mesodermico appaiato 2B (PHOX2B)
      - Normale 20 ripetizioni; Malattia 25 ÷ 29 ripetizioni
    - Sindrome della ipoventilazione congenita : Hash-1
      - Normale 13 ripetizioni; Malattia 5 ÷ 8 ripetizioni
    - Oloprosencefalia : ZIC2
    - Sindrome degli spasmi infantili : Omeobox correlati senza arista, collegata a X (ARX)
      - Normale 10 ÷ 12 ripetizioni; Malattia 17 ÷ 20 ripetizioni
      - Altre caratteristiche: Ritardo mentale; Lissencefalia; Genitali anormali
    - Ritardo mentale, collegata a X, con carenza dell'ormone della crescita isolata: SOX3
      - Normale 9 ripetizioni; Malattia 20 ÷ 31 ripetizioni
  - Disturbi scheletrici
    - Displasia cleidocranica (CCD)(Dominante) : Fattore α1 legante al nucleo (RUNX2)
      - Normale 11 ÷ 17 ripetizioni; Malattia 27 ripetizioni
    - Sinpolidattilia : HOXD13
    - Sindrome mani-piedi-genitale : HOXA13
      - Normale 18 ripetizioni; Malattia 26 ripetizioni
    - Sindrome blefarofimosi/ptosi/epicanto inverso (BPEIS) : FOXL2
Ripetizioni_p(AAG)_n
- Localizzazione: Introni
- Dimensioni delle ripetizioni
  - Normali: Gamma polimorfica (7 ÷ 22)
  - Grandi: Mutazione piena (200 ÷ 900)
- Malattia: Atassia di Friedreich
- Ereditarietà: Recessiva
- Meccanismo della malattia: Produzione di proteine ridotta

Altre malattie associate sequenze ripetute
- Instabilità di semplici tandem sequenze ripetute: Neoplasmie
  - Gene per il recettore TGF β di tipo II
    - Sequenze ripetute (GT)₃ e (A)₁₀
    - Le sequenze sono obiettivi per la mutazione con numerose copie
    - La mutazione produce frame shift e perdita del recettore
    - Elimina il controllo dei TGF β crescita delle cellule epiteliali
- Replicazioni: I disturbi possono essere associati con replicazioni di frammenti piccoli o grandi di DNA dentro il gene
  - SCA 10
    - Gene mutato: SCA 10
    - Ripetizione pentanucleotidica ATTCT nell'introne 9
    - Gamma normale delle ripetizioni: 10 ÷ 22
    - Clinica: Più grandi numero di ripetizioni correlato con età più giovane dell'insorgenza della SCA 10
  - Mioclone del baltico
    - Gene mutato: Cistatina B
    - Ripetizione di 12 paia di basi nella regione 5' promotrice
    - Gamma delle ripetizioni
      - Normale: 2 o 3 sequenze
      - Malattia: ~50 ÷ 75
  - Proteina prione: Contiene 24 paia di basi ripetute codificanti un octapeptide
    - Fenotipo normale: 4 ± 1 copie
    - Malattia neurologica di vari tipi di gravità: > 4 copie extra
  - Altri esempi
    - CMT 1A; MEN 2A (gene ret) ; Distrofia muscolare di Duchenne
    - CAG e ripetizioni GCG
- Malattia da espansioni nel trascritto ma non DNA traslato
  - DM1 (CTG)
  - DM2/PROMM (CCTG)
  - SCA8 (CTG)
  - SCA10 (ATTCT)
- Tendenza a produrre delezioni nelle sequenze ripetute
  - CMT 1A - HNPP
  - Distrofia facioscapoloomerale
- Ripetizione e silenziamento del gene indotto
  - Numero di copie del gene aumentat # ® Maggiore metilazione del gene e compattamento della cromatina
  - Maggioe repressione dell'espressione del gene
Disturbi da ripetizione: Malattie muscolari
- DM1 (CTG)
- DM2/PROMM (CCTG)
- OPMD (GCG)
- FSH (Delezione Kpnl ripetizione)

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26 ottobre 2007

Riferimenti

1. Human Mutation 1996;8:1-7
2. Human Molecular Genetics 1997;6:2005-2010
3. Neuron 1997;19:1147-1150
4. American Journal of Human Genetics: DNA structures 1999;64
5. American Journal of Human Genetics: CAG repeats 1999;64
6. Hum Mol Genet 2004;13:R235-R243

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