WUSTL - Botulismo; Tossina botulino

Fondazione FONAMA

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Traduzione di Natale Marzari

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Traduzione del 15 febbraio 2011

BOTULISMO ^⁴

Caratteristiche cliniche
Clostridio botulino
Diagnosi
Caratteristiche dei sottotipi
Meccanismi di azione
Patologia
Prevenzione
Prognosi
Struttura della proteina
Sindromi cliniche
Origine alimentare
Iatrogena: Generalizzata dopo iniezione locale
Colonizzazione GI
Infantile
Inalazione
Ferita

Collegamenti esterni
Armi biologiche: AMA (pdf)
Manuale CDC (pdf)
Movie

Emile Van Ermengem

Organismi causativi
- Clostridio botulino
  - Bacilli Gram positivi
  - Producenti spore
  - Prodotto sotto condizioni anaerobiche: Obbligate
  - Produzione di tossine
    - Può produrre tutte 7 i sierotipi di tossine: A-G
    - Informazione genetica
      - Tipo G nei plasmidi
      - Tipi C1 e D nei batteriofagi
      - Tipi A, B, E, e F nel cromosoma batterico
    - Legame alle emoagglutinine: ? inibisce degradazione by digestive enzimi
  - Collegamenti esterni: Arizona; Illustrazione
- C. baratii: Produce il sierotipo F
- C. butyricum: Produce il sierotipo E
Tossina botulino: Proteine e trasporto
- 7 tipi di tossine botuliniche neurotossiche: A , B , C1 , D , E , F , G
- Omologia della sequenza (30% ÷ 40%) alla tossina tetanica
- Prodotto come proteina a catena singola (protossina) con peso molecolare di 150 kDa
- Rilasciata dai batteri come parte di un complesso multimerico non covalente
  - Le proteine ausiliarie comprendono: Emoagglutinine (HA); Non tossina, non emoagglutinina (NTNH)
  - Il complesso può proteggere la tossina nel tratto GI a pH basso
  - Il complesso si dissocia spontaneamente a pH fisiologico
  - Nessun ruolo diretto delle proteine ausiliarie in bloccaggio della trasmissione colinergica indotto dalla tossina
- Scissione della protossina botulino: In 2 catene
  
  Tossina botulino
  di tipo B
  - Catena pesante (100 kDa)
    - La regione terminale C della catena pesante (H): Lega alla superficie delle cellule nervose bersaglio
    - La regione terminale N della catena H: Trasferisce la catena L attraverso le membrane
  - Catena leggera (L) (50 kDa)
    - Le catene leggere hanno un motivo legante allo zinco tetraedrico: Contenente
      - La sequenza aminoacida di consenso HELIH
        
        Comune ad altre metalloproteinasi dipendenti dallo zinco
      - 2 istidine, molecole di glutamato e acqua
      - Una struttura assomigliante alla endoproteasi simile alla termolisina
    - Contiene l'attività tossica
      - Endopeptidasi dipendente dallo zinco
      - Distacco delle proteine formanti l'attracco delle vescicole sinaptiche e fusione del complesso
    - Geometria 3 D: Siti catalitici approfonditi all'interno della proteina
  - Subunità pesante e leggera collegate da un legame a disolfuro
  - La doppia catena prodotta è la forma attiva: Inibisce la trasmissione colinergica
  - Proteasi producenti il distacco
    - Spesso contenute come sottoprodotti dell'organismo
    - Possono trovarsi anche nel tratto del GI
- La tossina passa dal tratto GI alla vascolatura: Meccanismi
  - Trasporto cellulare: Enterociti di assorbimento
  - Legando alla superficie apicale delle cellule epiteliali
  - Endocitosi mediata da un recettore
  - Transcitosi attraverso le cellule
  - Accettazione dalla superficie basolaterale delle cellule
  - L'abilità della tossina ad attraversare le cellule dipende dal
    - Tipo di tossina
      - Abili ad attraversare le cellule: Botulino di tipo A e B
      - Non abili ad attraversare le cellule: Botulino di tipo C e tetano
    - Catena pesante delle tossine botuliniche: Terminale C
- Le tossine fuoriescono dalla vascolatura alle regioni presinaptiche
  - ? Meccanismo
  - Non attraversano la barriera ematoencefalica
- Altre vie di assorbimento
  - Le tossine botuliniche possono essere assorbite dal sistema respiratorio
- Azione generale: Bloccano l'esocitosi
  - L'azione più potente: Bloccaggio dei terminali colinergici
  - Altri bloccaggio dell'esocitosi: Alle concentrazioni più alte della tossina
    - Altri terminali nervosi: Neopinefrina, serotonina
    - Cellule non neurali: Se presenti i recettori di membrana
- Collegamento esterno: Proteina botulino

Tossina botulino: Meccanismo di azione ai terminali nervosi presinaptici ²

Azione generale: Blocca il rilascio dei neurotrasmettitori ai terminali nervosi colinergici periferici
- Giunzioni neuromuscolari
- Terminali nervosi dell'autonomo: Ortosimpatico e parasimpatico
Elettrofisiologia delle placche terminali
- Frequenza degli MEPP: Ridotta
- Contenuto quantico dei EPP : Ridotta
4 PASSI nello sviluppo del bloccaggio presinaptico alle NMJ

Legame ai recettori sulle membrane presinaptiche non mielinizzate
- Mediato da: Terminale carbossilico (C) della catena pesante della tossina botulinica
  - Nello stato originale la catena pesante è associata con la catena leggera
- Recettori: Modello a doppio recettore
  - Primo recettore
    - Identificazione dei recettori: Gangliosidi con più di un acido neuraminico (sialico), per es. GT1b
    - Tipo di legame
      - Opera e chiave
      - Pochi o nessun cambiamento nella conformazione del legame della neurotossina botulino
      - Bassa affinità
    - Ruolo: Portare la tossina in prossimità del secondo recettore
  - Secondo recettore
    - Postulato essere una proteina integrale di membrana
    - Molecole candidate: Sinaptotagmine I e II
- Suscettibilità dei neuroni colinergici e non colinergici alle specifiche tossine botulino e tetano
  - Può essere correlata all'abilità delle tossine di legarsi ai recettori sui terminali presinaptici
Assorbimento della tossina dentro i terminali nervosi per endocitosi
- La tossina legata viene internalizzata per endocitosi
  - La tossicità del botulino viene inibita dall' antitossina botulino solamente nei 1° 30 minuti dopo l'esposizione alla tossina
- La catena L viene traslocata attraverso la membrane presinaptica attraverso un canale
- Traslocazione è mediata dal terminale (N) della catena pesante della tossina botulinica (H_N)
  - La catena pesante forma poi un canale rilasciando la catena leggera dentro il citoplasma del terminale
  - Dominio della traslocazione: Elica α increspata in H_N
  - E' necessario un pH basso nell'endosoma
    - ? Mette insieme i segmenti anfifilici/transmembrana del H_N a formare un canale di trasporto
    - ? Causa cambiamento di conformazione nel terminale N della catena pesante
Traslocazione attraverso la membrana dell'endosoma
- Generale: Movimento del dominio cataliticamente attivo dal lumen dell'endosoma al citosol
- Indotto dal pH
  - Induce cambiamenti conformazionali nel botulino che espongono il dominio idrofobo
  - Inibito dai farmaci che neutralizzano il pH endosomico (Clorochina)
- Inserzione della tossina nella membrana endosomica
  - Mediata dal terminale N della catena pesante
  - La catena pesante e quella leggera vengono separate
  - Catena pesante: Ha una doppia funzione
    - Canale e chaperone, per la catena leggera
    - Associazione con la formazione della scissura nella membrana endosomica
  - Catena leggera
    - Trasportata dall'endosoma al citosol
    - Nel citosol: Il pH più neutro ripristina la struttura della catena leggera

Inibizione dell'esocitosi del trasmettitore dal terminale presinaptico

Azione della tossina: Proteolisi dipendente dallo zinco dei componenti della proteina dell'esocitosi (complesso SNARE)
- Classe dell'enzima: Endopeptidasi
- Azione della tossina antagonizzate dagli inibitori della metalloproteinasi
  - Captoprile; Fosfamidone
- Inibizione prodotta da: Catene leggere delle tossine botulino e tetano
- La proteina del substrato può essere distaccata solamente prima dell'assemblaggio del complesso SNARE
- Attività della endopeptidasi osservata principalmente con la riduzione del legame a disolfuro tra 2 catene di tossine botuliniche

Obiettivi molecolari: Sottotipi di botulino e della tossina tetanica

Tossina clostridio	Proteina bersaglio distaccata
Botulino A B C D E F G Tetano	SNAP-25 VAMP (Sinaptobrevina) SNAP-25; Sintassina VAMP (Sinaptobrevina) SNAP-25 VAMP (Sinaptobrevina) VAMP (Sinaptobrevina) VAMP (Sinaptobrevina)

Generale
- Localizzazione dei substrati: Citosol dei terminali nervosi
- Substrati specifici
  - Proteina presinaptica SNARE coinvolta nell'esocitosi
  - I substrati peptidici in ciascuna proteina bersaglio hanno motivi comuni
- Meccanismo di azione: Proteolisi dei substrati
Proteine di membrana associate alle vescicole (VAMP; Sinaptobrevina)
- Presenti nelle vescicole sinaptiche contenenti trasmettitori
- Il sito distaccato è l'ansa extravescicolare della VAMP
  - Botulino di tipo B: Gln76-Phe77
  - Tetano: Gln76-Phe77
  - Botulino di tipo D: Lys59-Leu60
  - Botulino di tipo F: Gln58-lys59
Proteina sinaptosomica associata (SNAP-25 )
- Attaccata alle membrane sintassina e presinaptica
- Distaccata vicino al terminale C da
  - Botulino di tipo A: Gln197-Arg198
  - Botulino di tipo E: Arg180-Ile181
Sintassina 1
- Proteina di membrana presinaptica associata con
  - Canali Ca++ e SNAP-25
- Distaccata vicino al terminale C da
  - Botulino di tipo C1
  - Solo quando è nella membrana

Terminazione dell'azione
- Meccanismo sconosciuto
- La tossina di tipo A ha una azione più lunga del tipo B

Collegamento esterno: Movie (Onda d'urto)

Tossina botulino: Sottotipi e caratteristiche
- Tipo A
  - La manifestazione più comune nelle Montagne rocciose e USA occidentali
  - L'elevato livello di Ca⁺⁺ negli sinaptosomi supera il bloccaggio
  - La paralisi più grave e di più lunga durata: 67% con intubazione
  - Fisiologia
    - Miniatura dei potenziali della placca terminale (MEPP)
      - Frequenza: Ridotta
      - Ampiezza: Solitamente Ridotta
    - EPP: Contenuto quantico ridotto
  - Obiettivo del distacco: SNAP-25 (t-snare)
  - Maggior bloccaggio del rilascio spontaneo del trasmettitore del tipo B
  - La stimolazione ripetitiva evoca risposte post-sinaptiche
- Tipo B
  - La manifestazione più comune nell'est degli USA, specialmente nella gamma Allegheny
  - Ha una maggiore omologia strutturale con la tossina tetanica
  - Per agire richiede l'assemblato intracellulare dei microtubuli
  - Paralisi qualcosa meno grave del tipo A
  - Fisiologia
    - Miniatura dei potenziali della placca finale (MEPP): Riduzione nella frequenza normale o moderata
    - EPP: Contenuto quantico ridotto; Latenza variabile
  - Obiettivo del distacco: Sinaptobrevina 1 (VAMP) (v-snare)
  - Blocca l'effetto della Latrotossina α
  - La stimolazione ripetitiva non evoca risposte post-sinaptiche
- Tipi C e D
  - Scarsamente assorbite dall'intestino
  - Causa della malattia negli animali
    - Botulismo aviario: Tipo C; "Collo flessuoso"
    - Equini: Avvelenamento con foraggio (adulti); Sindrome del puledro scuotente
  - Solo raramente implicate nella intossicazione umana
  - Botulino C3: ADP ribosilato
    - Substrati: RAC1 ; ; RAC2 ; RAC3
- Tipo E
  - Si trova nei sedimenti di acque fredde
    - La manifestazione più comune nel Baltico, Alaska e negli stati dei grandi laghi
    - Associata con l'ingestione di pesce
- Tipo F: Prodotta da C. baratii
Botulismo: Caratteristiche cliniche
- Tempi di decorso
  - Periodo di incubazione:
    - Media: 18 ÷ 38 ore
    - Estremi: 2 ore ÷ 1 settimana
- Debolezza
  - Diffusa; Solitamente simmetrica; Prossimale > distale
  - Bulbare: Disfagia; Disartria
  - Extraoculare: Ptosi; Debolezza dei muscoli extraoculari
- Perdita sensoria: Mai preminente
- Riflessi tendinei
  - Ridotti
  - ? Meno coinvolti con il tipo E
- Autonomo
  - Colinergico
    - Pupille
      - Dilatate
      - Visione sfocata
      - Molti, ma non tutti i pazienti
    - Bradicardia
    - Ipotensione
    - Cute: Ipoidrosi
    - Ritenzione urinaria
    - Gastrointestinale
      - Nausea e vomito associati con cibo contaminato
      - Costipazione: Frequentemente il primo segno, specialmente negli infanti; Comuni successivamente
      - All'inizio si può avere diarrea
  - Laboratorio
    - Risposte cutanee ortosimpatiche: Assenti
    - Norepinefrina plasmatica: Ridotta
- Trattamento
  - Cure di sostegno
  - Anti-tossina: Umana
    - Tipo solitamente usato: Trivalente vs A, B, E
    - Può essere più efficace per il tipo E
    - Botulismo infantile: Riduce i tempi in ospedale, della ventilazione e del sondino naso gastrico
    - Antitossina dell'esercito USA: Eptavalente; Per gli attacchi bioterroristici
Botulismo: Diagnosi
- Elettrodiagnostica ¹
  - Stimolazione nervosa ripetitiva
    - Incremento: Con (40 Hz) o stimoli appaiati
      - Si ha nel 50% ÷ 60% dei pazienti
      - Può essere necessario esaminare molti muscoli per vedere l'incremento
      - Più comune con il botulismo di tipo B
    - Decremento alla RNS lenta: Occasionali pazienti
  - CMAP: Piccola
  - Potenziali delle unità motorie: Brevi
  - Reclutamento: Normale, o lievemente ridotto
  - SNAP: Normali
  - EMG: Denervazione muscolare; Fibrillazioni e picchi d'onda positivi
- Biopsia muscolare: Fibre angolari sparpagliate, fibre muscolari piccole
- Analisi del siero, feci e cibo implicato
  - Trasferimento passivo di siero o altri liquidi del corpo al topo
    - Tossicità del topo
    - Prevenuta selettivamente dall'antitossina
  - Culture di escrementi o ferita: Non utili nelle sindromi iatrogene o da inalazione
Botulismo: Sindromi cliniche

Origine alimentare
Colonizzazione del GI
Iatrogena
Inalazione
Ferita
- Botulismo di origine alimentare
  - Meccanismo della malattia: Correlata all'ingestione della tossina
    - Cibo
      - Contaminato con spore di Clostridio
      - Clostridio che cresce in condizioni anaerobiche: Produzione della tossina
    - Assorbimento
      - Stomaco: Non assorbito; Il complesso delle tossine con le proteine accessorie è resistente alla proteolisi
      - Intestino
        
        Il pH alcalino dell'intestino dissocia la tossina dalle proteine associate
        
        La tossina dissociata viene assorbita nella circolazione per endocitosi e traslocazione
  - Età: Solitamente adulti
  - Epidemiologia: Intossicazione più comune in California, Colorado, New Mexico, Illinois
  - Associazione a cibi
    - Vegetali inscatolati casalingamente, patatine e pesce e cibi marini conservati
    - Recenti epidemie: Te del cactus peyote; Crema di formaggio mascarpone
  - Trattamento
    - Cure di sostegno: Respiratoria; Sbrigliamento della ferita
    - Inizialmente
      - Emetici: Evitare quelli contenenti magnesio
      - Lavaggio
      - Enemi: Non in caso di paralisi dell'ileo
    - Antitossina
      - Più utile nelle 1° 24 ore
      - ABE trivalente
      - Ottenuta dal CDC: 404-639-3753 (giorno); 404-639-2888 (notte)
      - Uso alla diagnosi clinica: Senza aspettare la conferma dal laboratorio
      - Tasso di fatalità minore e accorciamento del malessere (Per Tipo A)
      - Complicazioni (immunitarie): 9%
    - ? Diaminopiridina 3,4
- Botulismo da ferita
  - Meccanismo della malattia: La tossina viene prodotta localmente da organismi nella ferita infetta
    - Nella ferita o ascesso
    - Dopo la proliferazione delle spore batteriche
  - Causa
    - Abuso di farmaci la più causa più comune
      - Intramuscolari o sottocutanea ("Pizzico cutaneo")
      - "Te nero" eroina
      - Ascessi sottocutanei (50%)
      - Più comune in California
    - Lesioni: Schiacciamento; Composizione di fratture
  - Periodo di incubazione 4 ÷ 14 giorni, più lungo quando la ferita è sbrigliata
  - Insorgenza: Visione sfocata e debolezza bulbare
  - Progressione
    - Debolezza generalizzata
    - Disartria; Disfagia
    - Reattività pupillare: Ridotta
  - Nessun cambiamento nella motilità gastrointestinale
  - Più comune in California
  - Tipi di botulino A > B
  - Elettrofisiologia
    - Ampiezza dei CMAP: Ridotta (50%)
    - RNS
      - 2 Hz: Decremento nel 50%;
      - 30 Hz: Incremento nel 50%
    - Potenziali delle unità motorie: Piccoli
  - Trattamento
    - Sbrigliamento della ferita
    - Penicillina
  - Prognosi
    - Frequenza della dipendenza ventilatoria: Tipo A > B > E
    - Lento miglioramento nella forza nel corso di settimane o mesi
    - 1 anno: Affaticamento ± più vicino al normale
    - Le funzioni dell'autonomo possono migliorare successivamente alla debolezza
    - Mortalità: 5% ÷ 10%
- Sindromi da colonizzazione del GI: Solitamente negli infanti (Botulismo infantile)
  - Meccanismo della malattia: La tossine viene prodotta localmente dagli organismi infetti nel tratto del GI
  - Esposizione: Ingestione di spore del clostridio botulino
    - Il miele crudo può essere una fonte di organismi di tipo B
    - Il Clostridio cresce meglio nei tratti del GI senza la flora normale
      - Giovani infanti: Prima che abbiano sviluppato la flora normale
      - Dopo un trattamento con antibiotici: Riduce la flora normale
      - Minore competizione dai normali organismi nel GI
    - Gli organismi producono la tossina nel tratto del GI
  - Epidemiologia
    - Si ha nel aree con spore di botulino nel suolo
    - USA: Comune in
      - California (50% dei casi negli USA), Utah, Pennsylvania e Hawaii
      - Caratteristiche del suolo nello Utah
        
        Alcalino, basso contenuto organico, praterie di artemisia
        
        C. botulino di tipo A
      - Caratteristiche del suolo dell'est degli USA
        
        Leggermente acidico, contenuto organico più alto, campi coltivati
        
        C. botulino tipo B
  - Insorgenza
    - Età: 1 ÷ 6 mesi; Media 4 mesi
    - Adulti: ~ 1 ÷ 2 mesi dopo ingestione delle spore
      - Fattori predisponenti
        
        Acloridria
        
        Antibiotici cronici
        
        Gastrectomia
        
        Intervento chirurgico intestinale
      - Tossine tipi: A; B; F (prodotte da C. baratii)
  - Clinica
    - Insorgenza: Acuta
    - Segni iniziali: Costipazione e debolezza
    - Debolezza
      - Occhi: Ptosi; Oftalmoplegia; Midriasi
      - Bulbare: Suzione e alimentazione scarse; Riflesso del vomito ridotto
      - Pianto debole
      - Ipotonia
      - Sofferenza respiratoria
    - Alterazioni del parasimpatico
      - Ipotensione
      - Tachicardia
      - Midriasi
  - Diagnosi
    - Escrementi: Culture e analisi per la tossina
    - Stimolazione nervosa ripetitiva: Incremento
  - Trattamento
    
    Incremento alla stimolazione nervosa ripetitiva rapida
    - Globulina immunitaria botulismo ⁵
      - Accorciamento della degenza in ospedale di ~17 giorni
      - Costo: $45,000 per paziente
    - Anti-tossina e antibiotici non efficaci
    - Cure di sostegno: Respiratoria; Nutrizione; Liquidi
  - Prognosi
    - Migliora spontaneamente senza trattamento
    - Tempi di decorso: Settimane ÷ mesi
    - Morte: Rara con adeguato supporto
- Iatrogena: Segni generalizzati dopo iniezione locale di botulino
  - Dose usata: All'interno delle linee guida terapeutiche
  - Debolezza: Generalizzata
  - Autonomo: Può essere coinvolto
  - Laboratorio: EMG d singola fibra anormale
- Sindrome di botulismo da inalazione ³
  - Esposizione
    - Tossine botuliniche aerosolizzate
    - Fonte: Bioterrorismo; Veterinaria
  - Prodromi GI: Nessuno
  - Segni iniziali: Disfagia; Pupille dilatate; Oftalmoparesi
  - Probabile epidemiologia nel bioterrorismo
    - Numerose casi: Molti gruppi simultanei
    - Comuni tempi e geografia, ma non cibo, o esposizione
    - Probabilmente non di origine idrica
    - Latenza: 12 ÷ 80 ore
    - Tipo di tossina insolita per quella area geografica
  - Trattamento
    - Supporto respiratorio
    - Antitossina: Più presto possibile
Botulismo: Prevenzione
- Inscatolamento o conservazione dei cibi con temperature appropriate, pressione, e pH basso
  - Spore
    - Sopravvivenza 2 ore a 100 °C
    - Inattivazione a 120 °C
    - La bollitura del cibo prima del suo inscatolamento ad alto punto di ebollizione può non inattivare le spore
    - Fattori favorenti la germinazione delle spore: Bassa acidità (pH > 5.0); Basso O₂; Alto contenuto di acqua
  - Tossine: Inattivazione dopo 1 minuto a 85 °C, o 5 minuti a 80 °C
- Evitare l'esposizione degli infanti al miele (può contenere spore del Clostridio botulino)
- Intossicazione da botulino: Nessuna immunità per gli episodi successivi
- Immunizzazione
  - Tossoide pentavalente
  - Usato solamente per il personale ad alto rischio: Operatori di laboratorio; Militari

Botulismo: Patologia dei terminali degli assoni

Terminali degli assoni alle giunzioni neuromuscolari (Ratto)
La tossina botulino induce ingrossamento delle NMJ (medio)
e germinazioni dei terminali nervosi (medio e sopra)
Vedi anche: Germinazioni dei terminali degli assoni

Tossina botulino, Tipo B

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Riferimenti
1. muscolo Nervi 2000;23:1137-1144
2. Nature Strutturali Biology 2000;7:617-619
3. JAMA 2001;285:1059-1070
4. Annu Rev PhBracciaacol Toxicol 2004;44:167–193
5. Neurology 2005;64:2029–2032

20 novembre 2007

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