Home, grave, Indice alfabetico, Collegamenti, Patologia, Molecole, Sindromi, Muscoli, Giunzioni neuromuscolari, Nervi, Spinale, Atassia, Anticorpi e Biopsia, Informazioni per i pazienti TRADUZIONE di Natale Marzari

 CLINICHE LABORATORY

PRINCIPLE:

In the histochemical reaction, phosphorylase agisce on the substrate, glucosio-1-fosfato e forms, nel presence di una glycogen primer, a polysaccharide composed of -1,4-glycosyl units. The nei vitro reaction of polysaccharide formazione è, comunque, the opposite della nei vivo action of glycogen degradazione. Questa happens perché the concentrazione della substrate è alto, e the concentrazione della inorganico fosfato è basso. The sistema equilibrio comunque favors glycogen formazione. Adenosin-5'-monophosphate funzioni come un activator.

Esposizione della sezioni ad un iodine soluzione dopo incubazione Risultano nei a varied color formazione nel newly formato polysaccharide. A negative reaction è yellow, e it ha been shown that unbranched catene di 4 a 6 glucosyl units will dare a negative reaction. A polysaccharide of 8 to 12 units gives a reddish color, seguito da various transitional colors come the lunghezza della catena aumenta. Chain lengths of 30 a 35 units dare a blue color. The reason the color è blue rather than red-brown è that the polysaccharide formato by the phosphorylase action è non normale glycogen. For glycogen to color a true red-brown, it ha to be branched, e branching will solo Avviene se branching enzima è allowed to act. Comunque, the action della branching enzima è eliminata by the inclusione of alcohol nel incubazione medium.

QUALITY ASSURANCE:

Questa enzima è molto labile e the preliminary Handling della specimen è della utmost importanza. Biopsies che sono stati totally immersed nei saline per any lunghezza of time o removed con a cauterio knife sono solitamente badly compromised. Comunque, there will la maggior parte delle spesso be alcuni areas of colore come opposed to the diffuse yellow color di una true negative colore.

SPECIMEN REQUIRED:

Snap frozen human striated muscolare. (Use the isopentano freezing method descritti altrove.)

Controls:

Use skeletal muscolare per a positive controllo. Omit the glucosio-1-fosfato per a negative controllo.

METHOD:

Fixation: Nessuno, use snap frozen tissue.

Tecnica: Cut 10 - 16 micron (12 µm) sezioni nei cryostat dal snap frozen biopsy. Attach uno o più sezioni to a No.1½, 22 mm square coverslip.

Equipment:

Ceramic colorazione rack - Thomas Scientific #8542-E40

Columbia colorazione dish - Thomas Scientific #8542-C12

Columbia colorazione dish(jar) - Thomas Scientific #8542-E30

Forceps

Latex gloves

Reagents:

Absolute alcohol ( 100% ethanol) - Quantum, FLAMMABLE store at room temp. nei a flammable cabinet

Acetic Acid (glacial acetic acid Fisher Scientific A507-500, store at room temp.)

Adenosin Monophosphate (Adenylic Acid, AMP) (Sigma A 1752, sodio salt; store at -20 C, desiccated)

Glucosio-1-Phosphate (Sigma G 7000; store at -20 C, desiccated)

Glycerol (Sigma G 8773, store at room temp.)

Glicogeno (Sigma G 4011, dal rabbit fegato, store at 0-5 C, desiccated)

Potassium Iodide (Sigma P 8256, TERATOGEN, store at room temp.)

Reagent alcohol, ACS - histological Fisher A962-4,o HPLC A995 FLAMMABLE, TOXIC, TERATOGENIC, store at room temp. nei flammable cabinet

Sodio acetate (Sigma S 9513, trihydrate, store at room temp.)

Sodio idrossido (Certified ACS pellets - Fisher S318, CAUTION CORROSIVE!!)

Solutions:

I. Glucosio-1-Phosphate, 1% (w/v)

Glucosio-1-fosfato 500 mg

Deionized acqua 50 ml

Store at -20 C nei 2.5 ml aliquots

II. Adenosin Monophosphate, 0.2% (w/v)

Adenosin monophosphate 100 mg

Deionized acqua 50 ml

Store at -20 C nei 2.5 ml aliquots

III. Sodio Acetato Solution, 0.1 M

Sodio acetate CH₃COONa3H₂O 2.72 g

Deionized acqua 200 ml

IV. Acetic Acid, 0.1N

CH₃COOH 0.575 ml

Aggiunge to deionized acqua 100 ml

IV. Sodio Acetato Buffer, pH 5.6, 0.1 M

Solution III: 181 ml

Solution IV: 19 ml

V. Glicogeno, 0.02%

Glicogeno 20 mg

Solution IV 100 ml

Store at -20 C nei 5 ml aliquots

VI. Ethanol, 95 % (v/v)

Reagent alcohol 95 ml

Deionized acqua 5 ml

VII. Lugol's Iodine Solution: (store at room temp. nei un amber bottle)

Potassium Iodide (KI) 1 g

Dissolve nei deionized acqua 1 ml

When completamente dissolved add iodine crystals (I₂) 0.5 g

When iodine è completamente dissolved add D.I. H₂O to a final volume 25 ml

VIII. Working Solution per Stain (prepare fresche per each assay)

Thaw aCapo e bring to room temperature

To a 20 ml glass beaker add solutions I, II, V

Aggiunge 1.5 ml 100 %(absolute) Ethanol

Adjust pH to 5.6

Staining Procedure:

1. Place coverslips con sezioni nei a columbia colorazione dish (Thomas Scientific #8542-C12) per 5 minuti at room temperature per a minimum of 45 minuti (overnight è molto acceptable).

2. Wash con numerosi exchanges of deionized H2O.

3. Aggiunge 6 - 8 drops of Lugol's Iodine to approx. 10 ml deionized acqua.

4. Aggiunge iodine soluzione to sezioni fino alla they sono scuro nei color.

5. Wipe the back della coverslip con a cotone tipped swab to remove eccesso iodine soluzione.

6. Mount coverslip onto a labeled glass slide con glycerol that ha been colored con a pochi drops of Lugol's Iodine.

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