Home, grave, Indice alfabetico, Collegamenti, Patologia, Molecole, Sindromi, Muscoli, Giunzioni neuromuscolari, Nervi, Spinale, Atassia, Anticorpi e Biopsia, Informazioni per i pazienti TRADUZIONE di Natale Marzari

 CLINICHE LABORATORY

PRINCIPLE:

"Diaphorase" è a term dati to flavoprotein enzimi that have the property of transferring hydrogen dal ridotta nicotinamide adenina dinucleotide (NADH) to various dyes. The hydrogen transfer riduce the dye. Solitamente tetrazolium composizioni function come the hydrogen acceptor when diaphorases sono being dimostrato histochemically, e the produce della riduzione è the acqua-insoluble formazan pigment. Comunemente usati tetrazoliums includono nitro blue tetrazolium (NBT). Enzymatic attività rilascia hydrogen dalla substrate, e the rilasciata hydrogen è transferred to the tetrazolium. Con the addition of hydrogen, the tetrazolium è convertito to purple-blue formazan pigment marking the site of enzima attività.

SPECIMEN REQUIRED:

Snap frozen human striated muscolare. (Use the isopentano freezing method previously descritti.)

Controls: Use skeletal muscolare o myocardium per a positive controllo. For a negative controllo, eliminate the substrate dalla incubating medium.

METHOD:

Fixation: Nessuno, use snap frozen tissue.

Tecnica: Cut 10 - 16 micron (12 µm) sezioni nei cryostat dal snap frozen biopsy. Attach uno o più sezioni to a No. 1½, 22 mm square coverslip.

Equipment:

Ceramic colorazione rack - Thomas Scientific #8542-E40

Columbia colorazione dish - Thomas Scientific #8542-C12

Columbia colorazione dish(jar) - Thomas Scientific #8542-E30

Forceps

Latex gloves

Reagents:

Acetone - Baxter #010-4, FLAMMABLE

Deionized acqua

Gelatin - 100 bloom -ICN 960317 store at room temperature

Glycerol -Sigma G 8773, store at room temperature IRRITANT

Nicotinamide adenina dinucleotide, ridotta (NADH)- Sigma N8129

Nitro blue tetrazolium - Sigma N6876), store at 0- 5 ^o C Phenol - Fisher A931-1, CAUSTIC, Store at room temperature

TRIS base (Tris[hydroxymethyl]aminomethane) - Sigma T6791, store at room temperature

TRIS HCl - Sigma T3253, store at room temperature

Solutions:

I. TRIS BUFFER 0.05 M, pH 7.6 @ room temperature

TRIS HCl 1.43 g

TRIS BASE 0.415 g

Deionized acqua 250 ml: Store refrigerated, prepare ogni Quattro to six settimane

II. NADH SOLUTION (8 mg/5 ml)

NADH 80 mg

TRIS BUFFER (soluzione I) 50 ml

Dispense 5 ml aliquots nella 13x100 mm glass tubes

Cover con caps

Store at -20 ^oC

III. NBT SOLUTION (10 mg/5ml)

Nitro-Blue Tetrazolium 200 mg

TRIS BUFFER (soluzione I) 100 ml

Store refrigerated nei a glass reagent bottle

Prepare ogni Quattro to six settimane

IV. ACETONE DESTAINING SOLUTIONS (30%, 60%, 90%): These solutions necessitano solo be approximate

30 % ACETONE 10 ml + Deionized acqua 20 ml

60 % ACETONE 20 ml + Deionized acqua 10 ml

90 % ACETONE 30 ml

V. Aqueous Mounting Medium (glycerogel)

Gelatin ( ICN#960317 - 100 bloom 4 g

Glycerol 25 ml

Phenol (CAUSTIC !) 0.5 ml

Deionized acqua 21 ml

1. Dissolve gelatin nei boiling acqua.

2. Cool, ma do non permettono to solidify.

3. Aggiunge phenol e glycerol.

4. Mix well.

5. Allow air bubbles nei mixture to dissipate prima usando!

Staining Procedure:

1. Thaw NADH soluzione.

2. Aggiunge 5 ml NBT soluzione to the tube con the NADH soluzione.

3. Incubate coverslips nei a columbia colorazione dish (Thomas Scientific #8542-C12) per 30 minuti at 37 ^oC.

4. Wash con tre exchanges of tap o deionized H2O.

5. Remove unbound NBT dalla sezioni con tre exchanges each della 30, 60 e 90 % acetone solutions nei l'aumento then decrescenti concentrazione. Leave the 90 % acetone covering the sezioni fino alla a faint purplish cloud è seen over the section.

6. Finally, rinse numerosi times con deionized H₂O e then mount the coverslips con the aqueous mounting medium onto a labeled glass slide.

Risultati:

Purple formazan precipitate è deposited at siti of mitocondrio nei sarcoplasmici network. Fibre di tipo I sono darker than those of tipo II. Walls of vasi sanguigni quindi sono stained.

REFERENCES:

1. Sheehan, D.C. e Hrapchak, B.B.: THEORY AND PRACTICE OF HISTOTECHNOLOGY Second Edition, Battelle Memorial Institute, 1987.

PREPARED BY	G. JAMES PLANER	10/22/90
SUPERCEDES REVISION	G. JAMES PLANER	04/27/94
REVISED BY	KAREN BIESER	07/16/97
ADOPTED BY	ALAN PESTRONK, M.D.
REVIEWED BY
REVIEWED BY
REPLACED

Va a Mitolario in italiano

Va a Mitolario italiano - inglese

Va a Mitolario inglese - italiano