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TRADUZIONE di Natale Marzari
 

 CLINICHE LABORATORY

PROTOCOLLO COLORAZIONE α-NAPTIL ACETATO ESTERASI

PRINCIPLE:

Questa protocol demonstrates the siti of non-specifico esterases nei tissue sezioni. Questa modificazione della technique descritti by B. J. Davis è a simple uno that demonstrates denervati fibre muscolari e delle giunzioni neuromuscolari

SPECIMEN REQUIRED

Snap frozen human striated muscolare. (Use the isopentano freezing method previously descritti.)

METHOD

Fixation: Nessuno, use snap frozen tissue

Tecnica: Cut 10 -16 micron (12 micron) sezioni nei cryostat dal snap frozen biopsy. Attach uno o più sezioni to a No. 1 ½ 22 mm, square coverslip

Equipment:

Ceramic colorazione rack - Thomas Scientific #8542-E40

Columbia colorazione dish - Thomas Scientific #8542-C12

Columbia colorazione dish (jar) - Thomas Scientific #8542-E30

Forceps

Latex gloves

Filter paper (Baxter #f2217-070, Grade 363 Qualitative)

Reagents:

Acetone - Baxter #010-4 FLAMMABLE

α- naphthyl acetate - Sigma N8505 - store desiccated at -20oC

Deionized acqua

Hydrochloric acid, ACS - Fisher A144-500, CORROSIVE, store at room temperature

Pararosaniline hydrochloride certified - Sigma P1528, store at room temperature

Permount - Fisher SP15-100, FLAMMABLE HEALTH HAZARD

Reagent alcohol, ACS - histochemical Fisher A962-4 o HPLC A995, FLAMMABLE, TOXIC, TERATOGENIC, store at room temperature nei flammable cabinet

Sodio nitrite certified crystalline - Fisher S347 o Sigma S2252, Forte OXIDIZER, COMBUSTIBLE

Sodio dibasic fosfato (Na2HPO4) anhydrous, ACS (FW 141.96)-Sigma S9763 o Fisher S374, o Mallinckrodt 7917: Store at room temperature

Xylenes - Fisher #HC700-1GAL, FLAMMABLE, store room temperature nei flammable cabinet)

Solutions:

1. 0.2 M Sodio Phosphate

Sodio fosfato dibasic, anhydrous (Na2HPO4) 5.678g

Deionized acqua 200 ml

Store at room temperature

2. 4% Pararosaniline HCl

Dissolve pararosaniline 0.5 g nei deionized acqua 10 ml

Calore gently on a hot plate (DO NOT BOIL)

Aggiunge concentrated (12N) hydrochloric acid 2.5 ml

Cool to room temperature

Filter (Baxter #f2217-070, Grade 363 Qualitative)

Store refrigerated (0-5oC)

3. 4% Sodio Nitrite

Sodio nitrite (NaNO2) 0.5 g

Deionized acqua 12.5ml

Store refrigerated (0-5oC)

4. "Azotized Pararosaniline" (PREPARED FRESH FOR EACH STAIN)

4% Pararosaniline-HCl (Solution #2) 0.4 ml

4% Sodio nitrite (Solution #3) 0.4 ml

Allow to sedere at room temperature per a pochi minuti. (Solution è amber nei color.)

5. Staining Solution (PREPARED FRESH FOR EACH STAIN): Into a 30 ml glass beaker ADD IN THE ORDER STATED

α-naphthyl Acetato ~ 3 - 5mg

Acetone ~ 0.75ml

MIX WELL

Aggiunge 0.2 M sodio fosfato (Na2HPO4) 12.5m

(SOLUTION MAY BECOME CLOUDY - OK!)

MIX WELL

Aggiunge Solution #4 ("Azotized Pararosaniline") e MIX WELL

SOLUTION WILL CHANGE COLOR dal YELLOW TO RED-BROWN IN LESS THAN FIVE (5) MINUTES !

6. Alcohol 50 %

Reagent alcohol ~50 ml

Deionized acqua ~50 ml

7. Alcohol 70 %

Reagent alcohol ~70 ml

Deionized acqua ~30 ml

8. Alcohol 80 %

Reagent alcohol ~80 ml

Deionized acqua ~20 ml

9. Alcohol 95 %

Reagent alcohol ~95 ml

Deionized acqua ~ 5 ml

Staining Procedure

1. Place coverslips nella a columbia colorazione dish (Thomas Scientific #8542-012)

2. When the Staining Solution (Solution %) è gold to oGamma nei color, add it to the coverslips nel colorazione dish per 5 minuti at room temperature.

3. Immediately place sezioni sotto a correre tap acqua per numerosi minuti to wash the reaction produce off the sezioni.

4. Pulire back of coverslips con cotone swab.

5. Place coverslips con se4ctions nei a ceramic rack (Thomas Scientific #8542-E40).

6. Dehydrate nei ascending alcohol solutions (50%, 70%, 80%, 95% x 2, 100% x2) - nei columbia colorazione dish(jar)s - Thomas Scientific #8542-E30.

7. Chiari con xylene (x - 4x) quindi nei columbia colorazione dish(jar)s - Thomas Scientific #8542-E30.

8. Mount coverslip onto a labeled glass slide con Permount o alcuni altre suitable organico mounting medium.

Risultati

Esterasi attività è dimostrato nei denervati fibre come a red-brown color con normale fibre exhibiting pale yellow to brown color (talvolta due i tipi di fibre può essere distinguished.) Giunzioni neuromuscolari, when presenti, sono dimostrato by a scuro red-brown deposit on the edge di una muscolare fibre.

REFERENCES

1. Thompson, SELECTED HISTOCHEMICAL AND HISTOPATHOLOGICAL METHODS, Charles C. Thomas, Springfield, IL, 1966.
PREPARED BYG. JAMES PLANER 10/22/90
SUPERCEDES REVISIONG. JAMES PLANER 12/14/94
REVISED BYKAREN BIESER 07/18/97
ADOPTED BYALAN PESTRONK, M.D.
REVIEWED BY
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12 agosto 1997

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