Fondazione FONAMA	fonama@fonama.org	Tel. 335250742
	Traduzioni a cura di Natale Marzari Dopo 41 anni e 5 mesi, nel maggio 2006 la magistratura di Trento ha riconosciuto l'esistenza  e  la gravità di quella malattia rara che nessuna altra istituzione o persona singola della provincia di Trento ancora mi riconosce, e per negare la quale ancora mi perseguita.    Natale Marzari

Il sistema ad alta energia.

Esperimenti di trasporto inverso di elettroni portarono negli anni 1950 a realizzare che dovrebbe esserci un comune intermedio non-fosforilato ad alta energia  tra i  portatori della catena respiratoria e la sintesi dell' ATP. Questo concetto è illustrato sotto. Le frecce mostrano la direzione normale del flusso, ma la maggior parte delle reazioni sono liberamente reversibili, e l'energia aggiunta al sistema via un processo può essere utilizzata da qualunque altra parte. Il sistema ad alta energia fu originalmente pensato essere una combinazione chimica, ma oggigiorno noi sappiamo che esso è in realtà il pH ed i gradienti elettrici sviluppati attraverso la  membrana interna mitocondriale.

E' possibile misurare i gradienti studiando la distribuzione di molecole permeanti attraverso la membrana mitocondriale interna. Questo richiede un metodo per la rapida separazione dei mitocondri dal loro mezzo di incubazione, sia attraverso una rapida ultrafiltrazione, o con una centrifugazione attraverso un strato di olio di silicone. Un marcatore impermeabile radioattivo (comunemente saccarosio) viene aggiunto alla incubazione al fine di corregge il mezzo esterno contaminante gli organelli.

Gli acidi grassi debolmente solubili possono essere usati per misurare il differenziale pH. Questo metodo sfrutta la facile permeabilità della membrana agli acidi liberi elettricamente  neutri, e l'impermeabilità ai loro relativi sali ionizzati. È vitale che l'acido libero attraversi la membrana in forma protonata senza movimento netto di cariche elettriche. In equilibrio la concentrazione dell'acido libero è la stessa dappertutto, ma il rapporto fra [ acido libero ] e [ sale ionizzato ] differisce nei due scomparti. Nello spazio della matrice la quantità di sale è proporzionale al pH interno, ma fuori dei mitocondri la concentrazione ionizzata nel sale dipende dal pH esterno. Se le concentrazioni interne ed esterne del sale possono essere
misurate allora l'applicazione dell'equazione di Henderson Hasselbach ci rende noto il pH interno.

 La misura del potenziale di membrana () richiede un catione permeante,  per es. un metallo alcalino radioattivo più valinomicina, o il tetrafenilfosfonio solubile nei del lipidi. In questo caso è importante che il catione penetri la membrana con netto movimento di  carica, in modo che la distribuzione del catione sia influenzata dal potenziale di membrana. Se le concentrazioni interne ed esterne di un catione permeant possono essere misurate, allora il potenziale della membrana può essere calcolato dall'equazione del equazione di Nernst.

Alcuni coloranti cambiano le loro proprietà di fluorescenza o di assorbimento quando sono stati allineati in un campo elettrico forte. Ciò fornisce un metodo alternativo per la misura continua del potenziale della membrana mitocondriale aggiungendo tali sostanze ad una sospensione mitocondriale. Le sostanze adatte includono le carbocianine, le fenosafranine ed i bisossonoli. Anche se è molto conveniente, questa tecnica deve essere calibrata usando il più vecchio metodo del punto singolo.

La somma del potenziale della membrana ed il gradiente pH sono conosciute insieme come energia motrice del protone (PMF). Ciò indica l'energia potenziale totale immagazzinata nel gradiente transmembranico, il quale è a disposizione per guidare i protoni nuovamente dentro la matrice , e fornire l'energia per i processi biologicamente utili. Usando il segno corretto per il gradiente pH (negativo!) e sostituendo i valori numerici per la costante di gas, la costante di Faraday e la temperatura assoluta, ne segue questo

PMF (in millivolt) = - 60pH

a 37oC. Il segno minus è confondente: il gradiente pH è egli stesso negativo, così i due componenti sono normalmente cumulativi nei loro effetti.

Nei mitocondri il gradiente elettrico,(150mV, interno negativo) dà un contributo più grande che il gradiente pH (0.5pH unità , interno alcalino). Nei cloroplasti il pH è più importante. Il pH mitocondriale corrisponde ad una differenza tripla nella concentrazione dello ione di idrogeno fra la matrice ed il citosol. Per ogni processo del transmembranico, il pH ed il componenti possono agire sia separatamente sia insieme, secondo la struttura degli enzimi e l'equilibrio del vantaggio biologico. Un movimento del protone trasporterebbe normalmente una carica positiva, ma possono muoversi pure altri ioni, così non c'è esigenza del protone ed i conteggi della carica per equilibrare per ogni individuale processo di trasporto membranale, anche se i totali devono equilibrare ovviamente globalmente.

Le migliori valutazioni correnti migliori per i conteggi della carica e del protone per la catena respiratoria sono indicate nella sezione sugli elementi portatori redox. Per ogni paio di elettroni che attraversano la catena, La NADH deidrogenasi sposta 4 protoni e 4 cariche positive esternamente attraverso la membrana interna dalla matrice verso il citosol, la citocromo c riduttasi dell'ubichinolo sposta 4 protoni e 2 cariche, mentre la citocromo c ossidasi sposta 2 protoni e 4 cariche. La ri-ossidazione del NADH per formare il NAD e l'acqua è così associata con l'esportazione netta di 10 protoni e di 10 cariche positve dalla matrice mitocondriale al compartimento citosolico.

La sintesi dell'ATP dalla F1ATPasi si pensa richiedere 3 protoni che trasportano 3 cariche positive per ri-entrare nella matrice. In più, 1 protone (ma nessuna carica) è necessari per l'assorbimento del fosfato e 1 carica (ma nessun protone) per lo scambio ATP/ADP con il citosol (vedi le pagine trasporto dei metaboliti per i particolari). Così il requisito generale è 4 protoni e 4 cariche per ogni ATP trasportato al mondo esterno. Ciò implica che il rapporto P:O è 2,5 per i substrati NAD-collegati, e 1,5 per il succinato, il quale è un poco più basso dei valori riportati nei manuali più vecchi, ma molto più vicino ai risultati sperimentali reali!

Il doppio strato lipidico della membrana interna è spesso soltanto circa 5nm ed è quindi conforme alle forze elettriche enormi:

La membrana interna ha una composizione insolita in fosfolipidi che include il cardiolipin (difosfatodilglicerolo) ed è specialmente "prova della perdita" di piccoli ioni.
 

The inner membrane has an unusual phospholipid composition which includes cardiolipin (diphosphatidylglycerol) and is particularly "leak proof" to small ions.

La maggior parte dei tipi di fosfolipidi formeranno spontaneamente i liposom una volta agitati con acqua, e questo è stato sfruttato per ri-costruire la catena respiratoria dai componenti purificati.