Fondazione FONAMA	fonama@fonama.org	Tel. 335250742
	Traduzioni a cura di Natale Marzari Dopo 41 anni e 5 mesi, nel maggio 2006 la magistratura di Trento ha riconosciuto l'esistenza  e  la gravità di quella malattia rara che nessuna altra istituzione o persona singola della provincia di Trento ancora mi riconosce, e per negare la quale ancora mi perseguita.    Natale Marzari

ATPasi F0F1

Questo enzima sostanziale (di circa 500.000 atomi) è facilmente visibile al microscopio elettronico come una sfera di 8,5 nm attaccata sul lato della matrice della membrana mitocondriale interna. Le sfere possono essere staccate con vari metodi, dopo i quali esse agiscono come ATPasi. La funzione fisiologica di questo enzima è la sintesi dell'ATP, usando l'energia immagazzinata nel pH transmembranico ed il gradiente di potenziale

L'insieme completo contiene una catena di 12 tipi diversi di polipeptidi. numerosi di questi sono presenti in molte copie. Il gruppo catalitico di testa è connesso ad uno stelo sensibile all'oligomicina una piastra di base conduttiva per i protoni nella membrana mitocondriale interna. Per ogni molecola di ATP elaborata dal complesso devono passare tre protoni attraverso la membrana dalla fase esterna P alla fase interna N del complesso.

Il gruppo di testa F1 contiene tre siti di legame nucleotidico, e l'enzima esegue probabilmente tre cicli-fase catalitici. Nella prima fase, l'ADP ed il fosfato si legano ad un centro attivo, il quale catalizza il legame ATP. Questo passo è energeticamente possibile poiché l'energia libera rilasciata dal leggero legame dell'ATP nel centro attivo viene compensata dall'Instabilità del nuovo legame fosfo anidride. L'energia dal protone fornisce la forza motrice richiesta per togliere l'ATP dal centro attivo.

Il pezzo base F0 alloggiato nella membrana mitocondriale interna è una turbina molecolare mossa dal gradiente protonico transmembranico. L'entrata dei protoni forza un collod'oca a rotare fra la piastra di base F0 ed il gruppo di testa F1, alterando la forma della subunità e questo movimento viene effettuato. Una seconda, delle proteine centrali la quale connette il gruppo di testa con il piede di base smorza e previene la tensione non necessaria quando lo stelo centrale ruota. L'energia è trasmessa alle subunità catalitiche nella ATP sintasi della parte della testa F! con la rotazione del collo d'oca. Il "collo d'oca" distorce le subunità proteiche, distruggendo la loro capacità di legare ATP. L'apporto energetico è usato per il rilascio dell'ATP, non per la formazione del legame.

E'  presumibilmente necessario inattivare il meccanismo catalitico nel centro che ha appena formato ATP (per impedire che questo centro idrolizzi i suoi propri prodotti) prima che distrugga la sua capacità di legare ATP. Questo fa si che il prodotto venga rilasciato. Mentre, gli altri due centri attivi stanno eseguendo la loro parte del ciclo catalitico. I tre centri attivi operano simultaneamente, ma fuori fase di 120^o. Essi fanno si che fino a 9 protoni (con la possibilità di arrivare a 12) producano una rotazione del collo d'oca e producano 3 molecole di ATP.  

Ricorda che l'intero complesso è reversibile. Norfmalmente l'energia del gradiente protonico è usata per fabbricare ATP, ma è egualmente possibile  pensare in vitro un'altra via, ed usare l'idrolisi dell'ATP per ruotare il collo d'oca, fino ad arrivare a pompare protoni all'indietro attraverso la turbina dentro il compartimento extramitocondriale. Se il piede di base F0 non è attaccato a membrane  non sarà utile, ed il complesso farà semplicemente una ATPasi, come originalmente osservato.

E' possibile osservare direttamente la rotazione del collo d'oca della ATPasi F1 usando un microscopio a fluorescenza, sebbene sia necessaria una considerevole ingenuità. Noji et al (1997) Nature 386, 299-302 usarono una ATPasi F1 geneticamente modificata di un batterio termofilo espressa in E. coli. Essi scaricarono il piede di base F0 e fissarono la testa del gruppo motore F1 ad una piastrina di vetro usando punti di polistidina attaccate al terminale N delle tre sottounità beta. Il vetrino era stato pretrattato con perossidasi horseradish associata al complesso nichel acido nitrilotriacetico, al quale la polistidina si lega con grande affinità. [L'acido nitrilotriacetico si lega a mezza molecola EDTA, così si ottengono delle posizioni di nichel scoordinate disponibili per legami esterni.]

I motori sono incollati alle larghe sottounità catalitiche, lasciando gli alberi motore esposti, e staccati dal vetro. Le unità secondarie gamma che formano l'albero sono state modificate
sul posto dirigendo la mutagenesi a rimuovere il Cys193 originale (che non conviene lontano dall'albero) e per sostituirlo con serina. Questi operatori inoltre hanno sostituito Ser107 nella regione del gambo con cisteina.

Questo singolo residuo di cisteina (l'unico nella molecola) potrebbe allora essere biotinilato, e collegato usando un marcatore streptavidin fluorescente, ai filamenti biotinilati dell'actina. [ Streptavidin ha quattro siti obbligatori della biotina.] I filamenti fluorescenti dell'actina erano molte volte più grandi dei motori legati ad essa ed hanno potuto essere visualizzati in un microscopio ottico. L'aggiunta di 2mM di ATP ha fatto ruotare in senso antiorario un piccolo numero di alberi motorio marcati con filamenti di actina per . Il film mostra i risultati che hanno ottenuto.

Film dell'ATPasi clicca sulla freccia a sinistra per avviare il filmino

Il movimento circolare inoltre si presenta nelle proteine che fanno ruotare i flagelli batterici, un altro importante sistema di enzimi che è guidato dall'energia motrice dei protoni. Appare che la ruota sia in uso continuo da almeno 2000 milioni di anni.