Fondazione FONAMA	fonama@fonama.org	Tel. 335250742
	Traduzioni a cura di Natale Marzari Dopo 41 anni e 5 mesi, nel maggio 2006 la magistratura di Trento ha riconosciuto l'esistenza  e  la gravità di quella malattia rara che nessuna altra istituzione o persona singola della provincia di Trento ancora mi riconosce, e per negare la quale ancora mi perseguita.    Natale Marzari

Sistemi di trasporto mitocondriale

Le normali operazioni della catena respiratoria creano un differenziale di pH ed un gradiente di voltaggio di 30.000.000 volt/metro fra i due lati della membrana mitocondriale interna. Questo richiede proteine di trasporto altamente specializzate per il controllo dei movimenti dei piccoli ioni attraverso la membrana, e la prevenzione della dissipazione dei vari gradienti.

La maggior parte dei portatori interni della membrana sono antiportatori che scambiano una molecola per un altra. Se le cariche elettriche sulle due molecole si equilibrano esattamente lo scambio sarà un processo elettricamente neutro ed il potenziale enorme della membrana non avrà effetto sul risultato. Tuttavia, il gradiente pH può interessare la posizione di equilibrio di uno scambio elettricamente neutro se uno o più partecipanti sono acidi o basici.  

I simportatori i trasportano due molecole nello stesso senso. Se le molecole hanno cariche opposte questo può ancora essere un processo elettricamente neutro. È sperimentalmente difficile da distinguersi fra un simporto di protone e un antiporto di idrossile.

Se le cariche delle molecole trasportate differiscono per i simportatori o gli antiportatori, allora ci sarà  un processo elettrico di trasporto (a volte denominato elettrogenico). Tali portatori inscatolano "il sentire" del potenziale di membrana, e ciò avrà un'influenza importante sul risultato. In generale i gradienti influenzati dal componente pH della forza motrice protonica sono ragionevolmente modesti, ma quelli influenzati dal potenziale della membrana sono notevoli.

In molto pochi casi (per es. per l'assorbimento del calcio) il portatore permette semplicemente che lo ione caricato attraversi la membrana. Ciò costituisce un uniportatore elettrico (o electrogenico). Il potenziale di membrana esercita pienamente il suo effetto, conducendo a gradienti di concentrazione notevoli se la reazione potesse raggiungere l'equilibrio.

I sistemi principali di trasporto sono elencati nella tabella qui sotto, la quale mostra inoltre alcuni degli inibitori principali.

Lo squilibrio della carica associato al portantore adenina nucleotide porta ad una grande differenza nel rapporto ATP/ADP fra la matrice ed il citosol. L'ATP ha effettivamente "una parola in più" nel citosol, perché la coppia ATP:ADP è mantenuta più lontana dall'equilibrio:
 

Le cellule tuttavia, non ottengono qualcosa per niente. Il trasporto dell'ATP, dell'ADP ed il fosfato attraverso la membrana mitocondriale interna costa un 33% di energia addizionale, sopra il minimo richiesto per la sintesi del ATP all'interno del compartimento della matrice mitocondriale. Questa energia supplementare deve essere assicurata dalla catena respiratoria. Un protone ulteriore è usato per alimentare entrambi questi sistemi di trasporto: la carica positiva di questo singolo protone alimenta lo scambiatore del nucleotide adenina, mentre la sua alimenta l'assorbimento del fosfato. I componenti pH ed elettrici della forza motrice protonica sono sfruttati separatamente.

Recentemente c'è stato un grande interesse verso la proteina portatrice ATP:ADP come possibile auto-antigene nella cardiomiopatia dilatativa, una malattia cardiaca comune e debilitante. Questo stesso enzima è coinvolto nella transizione di permeabilità mitocondriale e nella apoptosi.

L'alto ATP/ADP citosolico implica una concentrazione citosolica molto bassa di AMP, come conseguenza dell'equilibrio della miochinasi. Ciò permette al 5' AMP di servire da segnale di emergenza, quale indica una minaccia al rifornimento di ATP. Vari enzimi chiave (considerevolmente fosforilasi del glicogeno e la fosfofructochinasi) sono fortemente attivati dalle basse concentrazioni di 5'AMP. Questo nucleotide inoltre agisce sull'adenosina che stimola il flusso di sangue ai tessuti attivi. Si noti che 5'AMP differisce da  3'5 'ampère ciclico prodotto dall'adenile ciclasi.

La contrazione del muscolo richiede apparentemente un rapporto molto alto di ATP/ADP, ed è difficile mantenere un basso ADP miofibrillare perché non si diffonderà abbastanza rapidamente di nuovo ai mitocondri a bassi livelli di ADP. (Il tasso di diffusione è direttamente proporzionale alla concentrazione dei metaboliti.) I muscoli attivi contengono la fosfochinasi della creatina, (CPK) e grandi quantitativi di creatina e di fosfato di creatina. Queste sostanze si equilibrano con i gruppi del nucleotide adenina. Si pensa che le alte concentrazioni di queste fonti di energia altamente diffusibili aumentino il tasso massimo di trasporto di energia.

Gli esperimenti di knockout del gene hanno indicato che i topi che difettano sia degli isoenzimi mitocondriali che miofibrillari di CPK esibiscono uno sviluppo anormale, tuttavia i mutanti carenti in soltanto un isoenzima sono apparentemente sani. È difficile da vedere perché entrambi i geni del CPK dovrebbero essere
ampiamente mantenuti se non fanno nulla. Rimane essere stabilito se i singoli mutanti possono effettuare un lavoro sostenuto come quello del tipo di controllo.

Uno dei trasportatori asimmetrici più importanti è il portatore dell'aspartato, quale nei mammiferi gioca un ruolo chiave nella ri-ossidazione del NADH glicolitico dal  ciclo malato-aspartato. Questo ciclo è necessario perché la membrana interna non è permeabile a NAD o al NADH. Le reazioni componenti devono girare due volte per ogni molecola di glucosio ossidata dalla cellula. I due enzimi in questione, la malato deidrogenasi (MDH) e la ossaloacetato transaminasi del glutammato (GOT) sono fra il più attivi nel corpo. Entrambi gli enzimi esistono nelle varianti mitocondriali e citosolica, ma tutte e quattro le proteine sono codificate dai geni nucleari.

Viene scambiato l'aspartato con glutammato più un protone, così la forza motrice protonica è applicata interamente al portatore dell'aspartato. L'effetto generale deve influenzare questo ciclo altrimenti simmetrico, e mantenere il compartimento citosolico in uno stato relativamente "ossidativo" (con un basso rapporto NADH/NAD) mentre lo scompartimento mitocondriale è mantenuto corrispondentemente ridotto. Questa disposizione sopprime la formazione del lattato durante la glicolisi aerobica. Le specie invertebrate impiegano le spole alternative per realizzare lo stesso effetto, ed è dubbioso se le cellule eucariotiche potessero affatto funzionare senza una tale disposizione.

È importante rendersi conto che nessun portatore non significa nessun trasporto. Ossaloacetato e fumarate, per esempio, si legano molto male al portatore dicarbossilato, e non sono trasportati ad alcun tasso significativo. Se sia il malato che l'ossaloacetato fossero trasportati sarebbe impossibile mantenere il differenziale redox per le NADH/ NAD che esiste fra lo spazio matriciale mitocondriale ed il citosol.

I geni del portatore del metabolita sono situati nel nucleo e sono espressi soltanto in quei tessuti che li richiedono. Per esempio, i mitocondri del fegato hanno portatori per ornitina e citrullina, i quali sono richiesti per il ciclo dell'urea, ma questi non si ritrovano in altri tessuti. Il portatore del citrato viene trovato soltanto nelle cellule e negli adipociti del fegato, dove è necessario per la lipogenesi 

Il risultato di molti esperimenti di ossidazione del substrato in vitro è determinato dalla specificità del portatore. Per esempio: la maggior parte dei mitocondri animali ossidano il succinato almeno quanto il malato, perché nè il fumarato nè l'ossaloacetato possono essere esportati nella matrice e non c'è fonte di acetil-CoA per produrre il citrato.

Anche nei mitocondri del fegato, i quali possiedono un antiportatore del glutammato/idrossile, il glutammato è aggiunto solo principalmente dall'aspartato reso via transaminasi dell'ossaloacetato del glutammato (GOT), dalla deidrogenasi dell'ossoglutarate (OGDH), dalla tiochinasi del succinato (STK), dalla deidrogenasi del succinato (SADH), dalla fumarasi (FUM), dalla deidrogenasi del malato (MDH) e dal portatore dell'aspartato.

Tuttavia, se il glutammato ed il malato sono aggiunti insieme, i mitocondri mammiferi inizialmente producono un ammontare uguale dell'aspartato e dell'ossoglutarato usando la metà mitocondriale del ciclo malato - aspartato. I portatori dell'ossoglutarato e dell'aspartato, GOT, MDH e la catena respiratoria sono gli unici enzimi coinvolti in queste circostanze.

Domanda di autovalutazione: Se i mitocondri fossero incubati solo con ossoglutarato, quali vie sarebbero attive e quali composto (o composti) verrebbe formato?   

In alcuni casi, per es. per gli ioni calcio, viene utilizzato un portatore elettrico per l'assorbimento e viene usato un sistema elettricamente neutro per l'esportazione. I due componenti della forza motrice del protone sono usati per spingere lo ione in due direzioni opposte. Ciò può essere sfruttata dalle cellule per regolare il calcio intra-mitocondriale ad un valore differente dalla concentrazione citosolica..

Molti metaboliti importanti mostrano una distribuzione asimmetrica attraverso la membrana interna mitocondriale. Il funzionamento dei portatori elettricamente neutri dell'anione porta ad una modesta accumulazione di acidi polibasici (particolarmente citrato) all'interno dello spazio della matrice. Nel calcolo della distribuzione di equilibrio, è soltanto la "linea inferiore" che conta - il numero netto di protoni che ha attraversato la membrana e quali procedure per accumulare l'anione. Il meccanismo dettagliato è irrilevante, e tutti gli "scambi" intermedi sono scontati. Se la reazione generale per accumulazione elettricamente neutra del metabolita è:

allora una semplice considerazione sulle azioni di massa porta a concludere che:

Ciò è utile per il funzionamento del ciclo dell'acido citrico, ed inoltre ha implicazioni per la regolazione di glicolisi e della lipogenesi dalla fosfofruttochinasi e dalla acilCoA carbossilasi, dove il citrato è un effettore allosterico..

Esperimenti di gonfiamento mitocondriale: Se si vuole studiare il trasporto della membrana nell'isolamento è spesso necessario bloccare ulteriore il metabolismo con cianuro o rotenone. Gli studi più accurati sulla cinetica di trasporto coinvolgono la separazione veloce dei mitocondri dal loro mezzo di incubazione usando l'ultrafiltrazione o la centrifugazione attraverso l'olio a base di silicone. Questi esperimenti complessi e che richiedono tempo richiedono i
tracciatori radioattivi per correggere "l'apporto" del mezzo di incubazione nella frazione mitocondriale. Movimenti del metabolita su grande scala, tuttavia, producono alterazioni nel volume della matrice attraverso i meccanismi osmotici. Una valutazione qualitativa dei tassi di trasporto può essere ottenuta così misurando i cambiamenti nella dispersione della luce in una sospensione mitocondriale torbida.
 

Questi risultati sono stati ottenuti da 0.5 mg di mitocondri del fegato sospesi a pH 7 in una provetta dello spettrofotometro con 2.5 ml a 150 mM di acetato di potassio. Gli ioni dell'acetato possono penetrare velocemente tramite un processo elettricamente neutro come acido acetico libero, ma nessun gonfiamento è osservato inizialmente perché il potassio non può entrare. L'aggiunta di valinomicina non ha effetto perché questo ionoforo catalizza il movimento elettrico. La Nigericina permette uno scambio elettricamente neutro di ioni del potassio per i protoni ed avviene il gonfiamento veloce.

Il gonfiamento passivo nelle soluzioni saline isotoniche dell'ammonio può essere usato per studiare i sistemi principali di trasporto dell'anione nei mitocondri bloccati dal cianuro. I soluti abbassano passivamente i loro gradienti elettrochimici. Gli ioni dell'ammonio penetrano velocemente come ammoniaca libera senza movimento di carica, ed il gonfiamento è osservato se l'anione inoltre è trasportato tramite un processo elettricamente neutro. Può essere mostrato che il fosfato, il malato, lo succinato, l'ossoglutarato, il citrato ed il sodio tutto sono presi tramite meccanismi elettricamente neutri, ed possono essere dimostrati gli scambi fosfato/idrossile, fosfato/dicarbossilato, dicarbossilato/ tricarbossilato ed il malato/ossoglutarato. 

È inoltre possibile osservare il "gonfiamento energetico" usando mitocondri intatti in cui i soluti sono accumulati contro il gradiente di concentrazione usando l'energia proveniente da respirazione o dal ATP esterno. Ci sono differenze notevoli fra i processi energetici e passivi, ma in ogni caso (tranne le pompe alimentate dall'ATP) i movimenti netti degli ioni sono sempre lungo il gradiente elettrochimico.