Fondazione FONAMA	fonama@fonama.org	Tel. 335250742
	Traduzioni a cura di Natale Marzari Dopo 41 anni e 5 mesi, nel maggio 2006 la magistratura di Trento ha riconosciuto l'esistenza  e  la gravità di quella malattia rara che nessuna altra istituzione o persona singola della provincia di Trento ancora mi riconosce, e per negare la quale ancora mi perseguita.    Natale Marzari

Ossigrafia - misurazione con l'elettrodo ad ossigeno

Quando i mitocondri sono incubati in un apparato ossigrafico (elettrodo ad ossigeno) in un mezzo isotonico contenente substrato e fosfato, l'aggiunta di ADP causa un improvviso picco di consumo di ossigeno quando l'ADP viene convertito in ATP:

L'attività respiratoria rapida è chiamata "stato 3" della respirazione, mentre il tasso respiratorio più lento dopo che tutta l'ADP è stata fosforilata per formare ATP è chiamato "stato 4".

Lo stato respiratorio 4 è solitamente più rapido della velocità originale prima della prima aggiunta di ADP poiché alcune ATP vengono demolite  dalla attività della ATPasi contaminante il preparato, e l'ADP derivante viene poi ri-fosforilata nei mitocondri intatti.

Il rapporto fra [velocità stato 3] : [velocità stato 4] è chiamato  indice di controllo respiratorio (RCI) e indica la strettezza dell'accoppiamento fra la respirazione e la fosforilazione. Nei mitocondri isolati l'accoppiamento non è perfetto, probabilmente come risultato del danneggiamento meccanico durante le procedure di isolazione. I valori tipici del RCI variano in una gamma da 3 a 10, varianti con il substrato e la qualità della preparazione. Si pensa che l'accoppiamento sia migliore in vivo, ma non può però arrivare al 100%.

E' possibile calcolare un rapporto P:O (il rapporto fra la sintesi di ATP ed il consumo di ossigeno) misurando la diminuzione del tenore dell'ossigeno durante il rapido picco dello stato 3 della respirazione dopo aver aggiunto un quantitativo conosciuto di ADP. E' necessario sottrarre la respirazione basale dovuta all'accoppiamento imperfetto  ed al riciclaggio dell'ATP, come mostrato nel grafico sopra. Il cambiamento nella concentrazione deve essere quindi moltiplicato per il volume della camera, in modo che la risposta (in micro-atomi di ossigeno) possa essere correlata alla quantità di ADP aggiunta. La quantità di ossigeno nella camera viene calcolata dai dati pubblicati della solubilità dell'ossigeno alla temperatura adatta. Usando la figura del grafico qui sopra:

diminuzione in O₂ (dal grafico) = 0,135 mM; volume della camera = 2,5ml

atomi di ossigeno consumati nello stato 3 = 0,135 * 2 * 2,5 = 0,68 micro-atomi (nota il fattore di 2, tenendo conto di 2 atomi in una molecola di ossigeno)

iniettato ADP (20 microlitri di una soluzione a 50mM) = ATP formato = 1 micromole in totale

P:O = [ATP formato] : [ossigeno consumato] = 1,48 (per ossidazione del succinato)

I substrati collegati a NAD danno valori consistentemente più alti per il rapporto P:O (circa 2,5) paragonati con il succinato (circa 1,5). Questi risultati indicano che gli elettroni dagli agenti relativamente scarsamente riducenti tipo il succinato (anche l'acil CoA ed il glicerolo fosfato) entrano a parte lungo il percorso della catena respiratoria, saltando il primo sito di accoppiamento dove l'energia è catturata per la sintesi dell'ATP.

Le variazioni di forma della linea inclinata dopo l'esaurimento dell'ADP e nuovamente dopo che tutto l'ossigeno è stato usato implicano che i mitocondri devono avere una affinità molto alta per l'ADP e per l'ossigeno. La concentrazione di entrambe queste sostanze è molto bassa nella maggior parte delle cellule sane, poiché esse ne sono efficentemente ripulite dai mitocondri.

L'aggiunta di un agente di disaccoppiamento (come il dinitrofenolo o CCCP) porta ad un tasso di respirazione permanentemente alto in assenza di ADP, fino a che tutto l'ossigeno non è stato consumato.

Molti veleni naturali e sintetici bloccano la respirazione mitocondriale. Se i mitocondri sono incubati in un ossigrafo da esperimento con substrati e fosfato inorganico, le interazioni fra inibitori e disaccoppiatori permettono di distinguere i due maggiore tipi di inibizione:

La conclusione da trarre da questo tipo di esperimento è che il cianuro impedisce la respirazione bloccando la stessa catena respiratoria, così che il cianuro è efficace sia che siano o non siano aggiunti ADP o un disaccoppiatore. L'oligomicina d'altra parte inibisce il sistema di fosforilazione dell'ADP, così blocca solo la respirazione accoppiata nei mitocondri.