UMDF - MITO 101 Esaminazione approfondita di una sospetta malattia mitocondriale

Fondazione FONAMA

Tel. 335250742

Traduzioni a cura di Natale Marzari

Dopo 41 anni e 5 mesi, nel maggio 2006 la magistratura di Trento ha riconosciuto l'esistenza e la gravità di quella malattia rara che nessuna altra istituzione o persona singola della provincia di Trento ancora mi riconosce, e per negare la quale ancora mi perseguita. Natale Marzari

Esaminazione approfondita di una sospetta malattia mitocondriale

The Mitocondriali Medicine Society’s Committee on Diagnosis

Richard H. Haas a,*, Sumit Parikh b, Marni J. Falk c, Russell P. Saneto d, Nicole I. Wolf e,

Niklas Darin f, Lee-Jun Wong g, Bruce H. Cohen b, Robert K. Naviaux h

^a Departments of Neurosciences e Pediatrics, University of California San Diego, La Jolla, CA e Rady Children’s Hospital San Diego,

San Diego, CA, United States

^b Division of Neuroscience, The Cleveland Clinic, Cleveland, OH, United States

^cDivision of Human Genetics, The Children’s Hospital of Philadelphia e University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, United States

^d Division of Pediatric Neurology, Children’s Hospital e Regional Medical Center, University of Washington, Seattle, WA, United States

^e Department of Child Neurology, University Children’s Hospital, Heidelberg, Germany

^fDivision of Child Neurology, The Queen Silvia Children’s Hospital, Go¨ teborg, Sweden

^gDepartment of Molecular e Human Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, TX, United States

^h Departments of Medicine e Pediatrics, Division of Medical e Biochemical Genetics, University of California San Diego, La Jolla,

CA e Rady Children’s Hospital San Diego, San Diego, CA, United States

Ricevuto 8 ottobre 2007; ricevuto in forma riveduta 21 novembre 2007; accettato 21 novembre 2007

Estratto

La conferma della malattia mitocondriale e la stesura di una specifica diagnosi molecolare richiede una ampia esaminazione clinica e di laboratorio. L'origine da due genomi della malattia mitocondriale, le sue manifestazioni sistemiche multi-organiche, ed uno spettro di fenotipi riconosciuti in continuo aumento rappresentano la principale sfida diagnostica. Superare questi ostacoli, compendiando le informazioni provenienti da una varietà di modalità diagnostiche di laboratorio può spesso fornire prove sufficienti a stabilire una eziologia. Questo comprende misurazioni analitiche e istochimiche di sangue e tessuto, neuroimaging, esaminazione provocatoria, analisi enzimatiche su campioni di tessuto e colture cellulari, come pure analisi del DNA. Anche l'interpretazione dei risultati di queste indagini multisafccettate può diventare piuttosto complessa, il Comitato diagnostico della Società di medicina (MitocondrialeDiagnostic Committee of Mitochondrial Medicine Society) ha sviluppato questa rassegna per fornire una panoramica sulle metodologie emergenti e attualmente disponibili per la diagnosi di una malattia mitocondriale primaria, con un occhio di preferenza verso i disturbi caratterizzati dalla compromissione della fosforilazione ossidativa. Lo scopo di questo lavoro è quello di facilitare la diagnosi della malattia mitocondriale ai genetisti, neurologi, e altri specialisti metabolici che si trovano davanti alla sfida della esaminazione di pazienti di tutte le età con una sospetta malattia mitocondriale.

Esaminazione approfondita di una sospetta malattia mitocondriale

La principale malattia della catena respiratoria mitocondriale è un gruppo eterogeneo di disturbi caratterizzati da un metabolismo energetico danneggiato dovuta ad una presunta disfunzione della fosforilazione ossidativa (OXPHOS) su base genetica. Mentre la diagnosi è solitamente sospetta su basi cliniche ¹, sono spesso necessarie esaminazioni biochimiche e/o molecolari per confermare una diagnosi specifica. Sono stati proposti due schemi diagnostici

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* Corresponding author. Fax: +1 858 822 6707.
E-mail address: rhaas@ucsd.edu (R.H. Haas).

per la conferma della malattia mitocondriale, entrambi i quali
richiedono ampia esaminazione di laboratorio per determinare se un

dato paziente è ‘definitivamente’ affetto da una malattia mitocondriale ^2,3. La conferma dalla genetica molecolare è importante, quando possibile, per dare solidità alla diagnosi, e fornire una guida per la gestione e la prognosi, e permettere un accurato consiglio sul rischio di ricorrenza. I principali disturbi mitocondriali possono seguire il modello della ereditarietà materna (cioè, mutazioni del DNA mitocondriale (mtDNA)) o della classica ereditarietà Mendeliana (cioè, mutazioni del DNA nucleare (nDNA)). Comunque, la maggioranza delle

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malattie mitocondriali nei pazienti pediatrici è causata da mutazioni nel nDNA ⁴, più comunemente seguendo un modello autosomico recessivo di ereditarietà. La sfida sta nella determinazione di quale fra dozzine, se non centinaia, di geni estesi fra due genomi è la causa della disfunzione mitocondriale in un dato paziente.

Non esiste attualmente un insieme di linee guida uniformi o standardizzate per l'esaminazione biochimica e molecolare del paziente con una sospetta malattia mitocondriale. In tutto il mondo, in differenti laboratori vengono usati differenti metodi, con analisi enzimatiche di base critiche per una obiettiva esaminazione

della funzione mitocondriale non standardizzate fra i centri diagnostici ⁵. In aggiunta, mentre per lo studio è preferibile il tessuto fresco, spesso questo non è possibile a causa delle distanze geografiche ⁶ Le tecniche di diagnostica molecolare hanno la più grande riproducibilità inter-laboratorio ⁷. Comunque, le analisi del mtDNA presentano una particolare sfida diagnostica in quanto dei risultati falsi negativi possono derivare da un basso livello di eteroplasmia nei campioni del sangue periferico ⁸. In diversi laboratori sono sotto esaminazione varie metodologie molecolari per vincere questa sfida diagnostica.

Lo scopo di questa rassegna è quello di mettere in grado gli specialisti metabolici di navigare con successo attraverso le complicate e rapidamente evolventi esaminazioni del paziente con una sospetta malattia mitocondriale. Gli esami diagnostici di primo livello sono al di fuori dello scopo di questo elaborato ma sono stati indirizzati altrove ¹.

Piuttosto, qui viene fornita una panoramica delle opzioni di esaminazioni biochimiche e molecolari approfondite per la malattia mitocondriale che sono sia attualmente disponibili che emergenti all'orizzonte.
Gli algoritmi che forniscono una sistematica panoramica di queste esaminazioni sono visibili nella fig. 1. Le informazioni continuamente aggiornate sulle modalità diagnostiche per la malattia mitocondriale sono disponibili alla www.mitosoc.org.

Interpretazione analita biochimica minimamente invasiva

Analisi del lattato e del piruvato

L'innalzamento dell'acido lattico nel sangue (normalmente considerato >2,1 mM) o nel CSF può essere un importante, sebbene non-specifico, marcatore della malattia mitocondriale. i pazienti con una malattia mitocondriale, possono comunque, avere livelli normali di lattato e piruvato eccetto che durante una crisi metabolica o a seguito di esercizio ⁹. Inoltre, molti pazienti con una malattia mitocondriale hanno livelli compatibilmente normali o solo minimamente elevati di acido lattico, come avviene nelle malattie mitocondriali associate alla: gamma polimerasi (POLG1), nella neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON), nella malattia di Leigh, nella sindrome di Kearns- Sayre, e nella carenza del complesso I ¹⁰. Viceversa, innalzamenti dei livelli del lattato plasmatico e/o del piruvato possono essere visti in una gamma di condizioni diverse dalla malattia mitocondriale primaria, compreso l'innalzamento spurio dovuto a improprie tecniche di raccolta o manipolazione, all'innalzamento fisiologico come conseguenza di una disfunzione mitocondriale secondaria la quale può aversi in una ampia gamma di malattie sistemiche e disturbi metabolici, come pure per una carenza nutrizionale di tiamina ¹¹. E' ben noto che il lattato nel CSF può essere aumentato da infezione nel CNS, da ictus, da tumori maligni, infiammazione, e attacchi epilettici, i quali limitano il valore di

questi valori di laboratorio in l'assenza di altri rilevamenti obiettivi di conferma ¹².

Gli innalzamenti spuri del lattato plasmatico sono certamente le più comuni cause, derivanti dal ribellarsi del paziente (solitamente un bambino) o dall'uso prolungato di un laccio emostatico durante la raccolta del campione. Una utile strategia per risolvere questo problema è raccogliere il campione 30 minuti dopo l'inserimento di un catetere endovenoso. L'ottenimento di accurate misurazioni del piruvato può anche rappresentare una sfida ma è necessario per quantificare i rapporti lattato/piruvato nel sangue, i quali riflettono indirettamente lo stato di ossido-riduzione degli NADH/NAD⁺ citoplasmatici ⁹. Il piruvato è molto instabile, ed è quindi necessario che i campioni di sangue siano immediatamente trasferiti (cioè, entro 30 s dalla raccolta) in perclorato al 8% in ghiaccio e analizzati. I livelli del piruvato possono aumentare o diminuire a seconda della manipolazione del campione e sono elevati nel periodo immediatamente postprandiale. Il piruvato nel sangue e/o CSF può essere elevato nei difetti del metabolismo del piruvato come nella carenza di piruvato deidrogenasi, nella carenza di piruvato carbossilasi, o nella carenza di biotinidasi. Una elevata alanina plasmatica può essere un utile indicatore di una accumulazione di piruvato esistente da lungo tempo. Similarmente, i livelli del lattato o del piruvato nel CSF possono essere elevati senza innalzamento nel sangue in pazienti con una malattia mitocondriale con predominanti manifestazioni nel cervello ¹³. Mentre i difetti del metabolismo del piruvato sono basati geneticamente nelle malattie mitocondriali che chiaramente colpiscono nel differenziale della disfunzione della fosforilazione ossidativa primaria: una eccellente discussione su questi disturbi è disponibile altrove ^14,15.

Analisi degli aminoacidi

L'analisi degli aminoacidi viene condotta usando diverse metodologie, ciascuna con la propria forza e debolezza. I metodi più accurati usano la cromatografia a scambio di ioni con derivitizzazione post-colonna usando un analizzatore di aminoacidi automatizzato. Sebbene questo metodo permetta la più completa quantificazione degli aminoacidi, esso richiede il tempo di analisi più lungo. La spettrometria di massa tandem (MS/MS) è un metodo con crescente popolarità per le analisi degli aminoacidi dovuta al suo relativo basso costo e alta produttività, per quanto essa quantifichi scarsamente la glicina ¹⁶, la cistina, l'omocistina, la lisina, il triptofano, e il GABA; la maggior parte di questi sono neurotrasmettitori e sono coinvolti nelle reazioni di metilazione. La HPLC a fase inversa è un altro metodo relativamente sensibile e ad alta produttività per le analisi degli aminoacidi, ma anch'esso quantifica scarsamente il triptofano e la cistina.
L'analisi quantitativa degli aminoacidi non viene utilizzata spesso quanto sarebbe utile per diagnosticare specificatamente i disturbi del metabolismo mitocondriale . Comunque, questa esaminazione può essere una utile aggiunta quando è presente un innalzamento dell'alanina sia nel plasma che nel CSF, specialmente quando si ha iperalaninemia in un campione a digiuno (visto che si può avere un lieve innalzamento da una recente ingestione di un pasto ricco di carboidrati). E' possibile discernere l'innalzamento relativo dell'alanina comparandolo con l'aminoacido essenziale lisina (un normale rapporto alanina: lisina <3:1, con valori maggiori di questi

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Fig. 1. L'esaminazione approfondita di laboratorio di una sospetta malattia mitocondriale primaria implica entrambi i tipi di campione ottenuti in modo minimamente invasivo ed invasivamente. (a) Analisi degli analiti di plasma, urina, e CSF possono identificare anormalità indicative della malattia mitocondriale. (b) Panoramica delle esaminazioni basate sui tessuti in una sospetta malattia della catena respiratoria mitocondriale primaria.

indicanti una vera iperalaninemia) e alanina: fenilalanina + tirosina (rapporto normale <4:1) ¹⁷. Un innalzamento assoluto dell'alanina sopra 450 μM è un fattore utilizzato per determinare la probabilità di una malattia mitocondriale nel protocollo diagnostico di Nijmegen ³. Le analisi degli aminoacidi urinari vengono tipicamente condotte in presenza di scarso bicarbonato serico.

Una generalizzata aminoaciduria associata ad acidosi tubulare renale e glicosuria compresa la sindrome renale di Fanconi, possono essere viste nelle malattie mitocondriali, in particolare quelle coinvolgenti delezioni del mtDNA ^18,19.
Similmente ad altri marcatori biochimici di disfunzione mitocondriale , la sensibilità di una alanina elevata per la malattia mitocondriale è

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bassa, sebbene possa essere elevata solo in certi momenti come durante uno sforzo fisiologico o una regressione. Perciò, livelli normali di alanina non escludono la diagnosi di malattia mitocondriale. La forza dell'incorporazione della misurazione dell'alanina nella esaminazione della malattia OXPHOS è la relativa resistenza della quantificazione dell'aminoacido agli artefatti di una impropria raccolta del campione. Altri aminoacidi i cui innalzamenti sono stati associati con la disfunzione mitocondriale includono la prolina, la glicina, e la sarcosina ¹⁷. Sta aumentando sempre più la rilevazione di pazienti con malattia mitocondriale con grave malattia epatica ad insorgenza infantile dovuta ad una delle sindromi da deplezione del mtDNA che hanno elevata tirosina agli studi di screening neonatali, ma senza un aumento del succinilacetone come sarebbe diagnosticato nella tirosinemia di tipo 1.
La quantificazione degli aminoacidi può essere condotta nel sangue (plasma o siero), nelle urine, e nel CSF, sebbene l'esaminazione delle urine è tipicamente di solo aiuto nelle diagnosi di una malattia mitocondriale associata a tubulopatia. I campioni di sangue sono raccolti in una eparina o provetta EDTA con immediata separazione del plasma. Tutti i campioni devono essere refrigerati. I metodi quantitativi hanno un più alto valore diagnostico e sono clinicamente più significativi delle analisi qualitative. I risultati degli esami possono certamente venire alterati da una varietà di condizioni, compreso una impropria manipolazione del campione, emolisi, e apporto dietetico. Una impropria conservazione dei campioni causa un artificiale innalzamento del glutamato (specialmente in rapporto alla glutamina), aspartato, e ornitina, con decremento della glutamina, cistina, asparagina, e omocistina. L'emolisi causa un artificiale abbassamento dell'arginina ed elevazione degli aspartato, glutamato, ornitina, fosfoserina, e taurina. I campioni post-prandiali comunemente causano una generalizzata aminoacidemia compreso l'innalzamento degli aminoacidi a catena ramificata (valina, isoleucina, e leucina) e alanina; i campioni a digiuno possono evitare questa trappola.

Analisi degli acidi organici

Gli acidi organici sono sottoprodotti del catabolismo delle proteine, dei carboidrati, e dei grassi. L'analisi degli acidi organici può essere condotta in due modi diversi. Le analisi qualitative identificheranno errori congeniti del metabolismo con grandi escrezioni di acidi organici diagnostici, mentre le analisi quantitative permettono l'identificazione di anormalità più sottili e la puntualizzazione nel tempo della loro comparsa. Le analisi vengono spesso condotte con cromatografia a colonna di gas seguita dalla spettrometria di massa, con quantificazione fornita dalla analisi del rapporto ionico o dalla analisi della diluizione degli isotopi stabili. Mentre il secondo metodo è più accurato, esso non è pratico per uno screening sistematico e viene utilizzato solo per la quantificazione di specifici acidi organici (per es. per la quantificazione del mevalonato per la diagnosi della carenza lieve di chinasi mevalonica o la sindrome da iper IgD). I metodi più seguiti per la quantificazione degli acidi organici a scopo di screening includono il metodo della estrazione del rapporto ionico con la spettrometria di massa e le analisi semi-quantitative utilizzanti la gas cromatografia a fiamma con rilevazione per ionizzazione con la spettrometria di massa l'identificazione dei picchi ²⁰.

Le urine sono il campione preferito per lo screening degli acidi organici a causa della pronta escrezione ed alla più grande efficienza dell'estrazione nelle urine comparata con il plasma. Le limitazioni alle analisi degli acidi organici delle urine sono l'artificiale minore accuratezza in campioni di urina molto diluita, e raramente, picchi interferenti causati da farmaci. Alcuni analiti con più grande volatilità come l'acido propionico possono essere persi a causa della perdita durante la preparazione del campione o nella eluzione con il picco di solvente. Le analisi degli acidi organici possono anche essere condotte su CSF e plasma in scenari clinici selezionati. Le analisi degli acidi organici plasmatici forniscono raramente informazioni diagnostiche che fossero sfuggite alle analisi delle urine, ma possono essere usate per la quantificazione simultanea del lattato e dei corpi chetonici nel plasma e nelle urine. Similarmente, le analisi degli acidi organici nel CSF hanno utilità in scenari clinici selezionati, come nei disturbi del metabolismo del GABA.

Le analisi degli acidi organici delle urine vengono eseguite routinariamente negli infanti con encefalopatia ad insorgenza improvvisa nello sforzo di identificare acidopatie amino e organiche, come pure per alcuni disturbi dell'ossidazione degli acidi grassi. Le analisi degli acidi organici urinari durante un periodo di stabilità clinica possono avere una bassa sensibilità per la rilevazione della malattia mitocondriale, dato che le anormalità sono presenti spesso solo quando un paziente è acutamente sintomatico. Sorprendentemente, l'innalzamento dell'acido lattico nelle analisi degli acidi organici urinari non è un buon discriminatore per le citopatie mitocondriali ⁶. L'aumentata escrezione degli intermedi del ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA), acido etilmalonico, e acido 3-metil glutaconico avviene comunemente nella malattia mitocondriale, ma sono raramente diagnostici di uno specifico disturbo mitocondriale ^21–23. Notare, l'immaturità renale è una causa comune di innalzamento degli intermedi del ciclo TCA nelle urine. Perciò, gli acidi organici risultanti anormali nelle urine in infanti di meno di 1 anno di età devono essere interpretati con cautela per assicurarsi che i valori normali riportati siano età-specifici. Un altro comune rilevamento nelle analisi degli acidi organici urinari in persone con una malattia mitocondriale è l'aciduria dicarbossilica, derivante come un risultato del metabolismo microsomale degli acidi grassi. Questo è causato dalla compromissione della ß-ossidazione mitocondriale degli acidi grassi dovuta a carenza primaria o inibizione secondaria. Comunque, l'aciduria dicarbossilica può anche essere il prodotto di artefatti dietetici (cioè, trigliceridi a media catena), farmaci, e prolungato digiuno. La scarsa massa muscolare (causata da inedia o da vari disturbi muscolari primari e secondari) e difetti della sintesi della creatina possono produrre un apparente falso innalzamento degli acidi organici i cui risultati sono normalizzati dalla concentrazione della creatinina nelle urine.

Analisi della carnitina

La carnitina funziona come una spoletta mitocondriale per gli acidi grassi liberi e come accettore chiave dei potenzialmente tossici esteri del coenzima A (CoA). Essa permette il ristabilimento del CoA intramitocondriale e rimuove dai mitocondri gli intermedi esterificati rendendo possibile la loro escrezione urinaria. La quantificazione dei livelli della carnitina ematica e della carnitina libera, insieme al profilo della acilcarnitina permettono l'identificazione dei difetti della ossidazione degli acidi grassi, come pure di alcune aminoacidemie

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primarie e acidemie organiche. In aggiunta, questa analisi permette l'identificazione di difetti della ossidazione secondaria degli acidi grassi e della carenza di carnitina la quale può aversi nei disturbi OXPHOS primari.
Le analisi quantitative della acilcarnitina sono effettuate o con la spettrometria di massa tandem (MS/MS) o con HPLC seguite da ionizzazione elettrospray (ESI)-MS/MS. Le MS/MS tradizionali usano un gruppo butirrile per la derivitizzazione, il quale porta alla perdita di un terzo delle specie delle acetil-carnitine. Esse possono anche produrre sia una sopra che sotto-quantificazione di alcune specie aciliche (per es., la valprol e la ottanol-carnitina) per via del fatto che hanno la stessa massa ²⁴. Il plasma per le analisi proviene da campioni raccolti in una provetta EDTA o con eparina e congelato fino al momento delle analisi. Può essere utilizzato un puntato di sangue su carta da filtro, ma devono essere usate scale differenti dalle normali poiché negli elementi cellulari inclusi nel puntato sono presenti specie di acilcarnitina a catena lunga in più alte proporzioni . I profili urinari delle acil-carnitine sono spesso difficili da interpretare perché nei reni vengono prodotte varie forme aciliche e le acil-carnitine a catena molto lunga non sono routinariamente escrete.

Una volta quantificati sia i valori assoluti delle specie di acilcarnitine ed i rapporti di certi esteri delle acil-carnitine, possono essere utili nel supporto di una specifica diagnosi. L'esame è limitato dai falsi negativi in persone con carenza totale di carnitina e dagli innalzamenti della carnitina in pazienti trattati, come pure nei casi nei quali l'anormalità biochimica è di gravità lieve o fluttuante. Vedi figura 1a per una panoramica sui rilevamenti presenti negli screening analitici ad invasività minima nelle malattie mitocondriali.

Analisi biochimiche del sistema nervoso centrale basate sulla MRS

Le immagini a risonanza magnetica nucleare (MRI) sono una modalità importante nella esaminazione delle strutture anatomiche nei disturbi neurometabolici . Sfortunatamente, le malattie mitocondriali rappresentano una classe di malattie nelle quali rilevamenti alla MRI, se presenti, non sono specifici o cambiano nel corso del tempo, riducendo così la loro sensibilità diagnostica ^25–27. Comunque, si è evoluta una nuova tecnica di neuroimmagini, la risonanza magnetica spettroscopia protonica (MRS) dalla quale possono essere ottenute importanti informazioni metaboliche utilizzando gli stessi parametri di acquisizione necessari per la MRI. La MRS si basa sulla capacità di piccole molecole di emettere onde radio alle variazioni degli spin nucleari di protoni, neutroni, e nuclei atomici. La MRS protonica (¹H) è la tecnica spettroscopica usata più comunemente per le esaminazioni neurometaboliche.
Numerose sostanze coinvolte nella fisiologia mitocondriale sono rintracciabili con la MRS basata sulle variazioni delle loro proprietà chimiche entro campi elettrici e questo fa della MRS un utile ausilio nella esaminazione di una sospetta malattia mitocondriale ^26,28–30. Ogni sostanza metabolica rintracciabile emette una unica frequenza di risonanza chiamata deriva chimica, la quale è espressa in parti per milione (ppm) ed è derivata dalla frequenza ed accoppiamento di Larmor. I picchi di deriva chimica più comunemente studiati sono il lattato (1,33 ppm), lo N-acetil-L-aspartato (2,02 ppm), il succinato

(2,39/2,40 ppm), la creatina totale (3,03 ppm), la colina (3,22 ppm), ed il mio-inositolo (3,55 ppm). L'area del picco è proporzionale al numero degli spin che producono il segnale ed è una stima molto grossolana della concentrazione del metabolita.
L'interpretazione della MRS si basa semplicemente sulla ispezione visiva del picco e non è un metodo affidabile, dato che le molecole possono condividere una deriva chimica simile o avere una risposta magnetica alterata ai vari tempi delle misurazioni dell'eco (TE). L'uso di vari tempi di TE può consentire che alcuni picchi diventino più evidenti, dipendendo dalla forza magnetica (macchine MRI con 1,5 T rispetto a macchine con 3,0 T). Quando si usano macchine MRI a 1,5 T, la risonanza lipidica a 1,0–1,7 ppm può mascherare il picco di risonanza del lattato a 1,33 ppm con TE a tempo breve (cioè, 35 ms). Comunque, se combinati con i tempi intermedi di TE (cioè, 135 ms), il picco del lattato si inverte diventando distinto. Quando si usano macchine a 3,0 T a causa della larghezza di banda più ristretta, l'inversione del lattato a 135 TE non si distingue; perciò, può essere necessario un maggiore tempo di TE (cioè, 288 ms) per ridurre (gli effetti ndt) del materiale lipidico contaminante e definire il lattato. Attualmente, la maggior parte dei centri clinici di spettroscopia riportano i rapporti dei picchi di area perché i segnali MRS che loro acquisiscono non sono calibrati (figure. 2 e 3). Idealmente, ogni macchina dovrebbe essere calibrata prima del suo uso clinico con sostanze pure a concentrazioni conosciute per standardizzare ogni misurazione dei metaboliti sia entro una particolare macchina sia fra macchine differenti. Inoltre, si devono utilizzare precisi modelli computerizzati per determinare l'area sotto il picco per interpretare appropriatamente le concentrazioni dei metaboliti puri e rimuovere i possibili contaminanti artefatti. Fino a che una tale precisione non diventa routine nella interpretazione dei segnali e nei rapporti, le comparazioni non saranno pienamente affidabili fra differenti centri di spettroscopia e la piena utilità della MRS non sarà accettata.

Fig. 2. MRI del cervello dimostrante una sequenza FLAIR assiale in un ragazzo di 17-anni con una difficoltà respiratoria di nuova insorgenza, vomito episodico, ed estrema affaticabilità. Questa figura rappresenta le regioni simmetriche di elevati segnali T2/FLAIR localizzate entro il tegmentum (frecce). La diagnosi è stata sindrome di Leigh.

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Fig. 3. (A) Questa scansione MRS del cervello rappresenta un voxel di 1,6 x 1,6 cm entro la regione a FLAIR iperintenso. L'esatta locazione può essere vista sulle immagini MRI rappresentate sulla destra dell'immagine. Il tempo dell'eco (TE) è di 35 ms. C'è un picco verso l'alto del lattato (Lac) localizzato a 1,33 ppm, un picco del N-acetil-Laspartato (NAA) a 2,02 ppm, un picco della creatina totale (Cr) a 3,03 ppm, un picco della colina (Cho) a 3,2 ppm, ed un picco del inositolo (Ins) a 3,8 ppm. E' probabile che il voxel possa includere del liquido cerebrospinale. Non era rintracciabile lattato nel liquido cerebrospinale numerosi giorni prima dell' acquisizione dell'immagine. (b) Questa scansione MRS rappresenta lo stesso voxel di 1,6 x 1,6 cm voxel che in (A). Il tempo dell'eco (TE) è di 135 ms. Notare il picco Lac verso il basso a 1,3 ppm, mentre il picco NAA a 2,02 ppm, il picco Cr a 3,03 ppm, ed il picco Cho a 3,2 ppm rimangono verso l'alto. In questa TE, il picco Ins non è ben visualizzato.

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Il lattato non viene rilevato sopra lo sfondo dei lipidi negli infanti, nei bambini, e negli adulti normali. Quando a causa delle carenze della catena respiratoria mitocondriale il metabolismo deriva alla glicolisi anaerobica, comunque, i livelli del lattato nel tessuto cerebrale aumentano (Figure. 2 e 3). Barkovich ed al. rilevarono picchi del lattato (Lac) in 5 su 5 pazienti diagnosticati con la sindrome di Leigh o con la miopatia mitocondriale, encefalopatia, acidosi lattica e episodi di simil-ictus (MELAS) ²⁶. In ulteriori studi con due gruppi differenti, i picchi Lac sono stati visti in tutti 13 i pazienti con la MELAS che vennero studiati ^31,32, come pure in 18 su 21 pazienti con una varietà di carenze della catena respiratoria ³³. Comunque, proprio come i livelli del lattato nel sangue hanno solo una moderata sensibilità per la malattia mitocondriale, i picchi Lac nel cervello alla MRS sono anche loro non altamente sensibili. Due studi mostrarono la sensibilità dei picchi Lac nelle malattia mitocondriale essere del 18–27% ^34,35. I picchi Lac variano a seconda che un paziente si trovi in uno stato di esacerbazione della sua malattia ³⁰, come pure dallo stato delle sue lesioni, se sono acute, sub-acute, o croniche ²⁸. La rilevazione del segnale Lac può dipendere anche dalla sua concentrazione, dato che la soglia di rilevazione alla MRS è 0,5–1 mM ^34,35. Similmente, l'assenza del picco Lac non esclude la malattia mitocondriale, e poiché nella malattia mitocondriale sono coinvolti vari specifici tessuti , e non necessariamente è coinvolta la localizzazione cerebrale. La specificità della MRS per la malattia mitocondriale è ulteriormente limitata dalla possibilità che altre condizioni siano all'origine dei picchi Lac ³⁵. Comunque, nello scenario di un sospetto clinico e biochimico di una malattia mitocondriale, l'identificazione di un picco Lac aggiungerebbe peso alla sua probabilità e potenzialmente fornirebbe prove per più sostanziose e più invasive esaminazioni diagnostiche.
L'N-acetil-L-aspartato (NAA) è predominantemente localizzato nei neuroni, negli assoni, e nei dendriti ³⁶. Le misurazioni MRS del NAA appaiono essere uno dei migliori surrogati dei biomarcatori per l'integrità neuronale. NAA è sintetizzato dentro i mitocondri con un procedimento che richiede energia e può rappresentare un funzionale marcatore mitocondriale entro le popolazioni neuronali. Una diminuzione nei livelli del NAA in rapporto alla creatina può riflettere una malattia mitocondriale ³⁷. Il rapporto di ogni metabolita con la creatina è usato come un valore di rapporto standard dovuto agli abbastanza uniformi livelli della creatina nel CNS nella maggioranza delle persone. In 15 pazienti con una sindrome di malattia mitocondriale, sono state viste riduzioni del rapporto NAA/Cr nel cervelletto nel 93% e in regioni della materia grigia corticale nel 87%, a volte persino quando queste aree apparivano normali alla MRI ²⁹. Inoltre, si vedeva una stretta espressione regionale del NAA, senza diminuzione del segnale NAA/Cr nella materia bianca. In più, in un altra serie di 16 pazienti con malattia mitocondriale definitiva coerente o con altre sindromi conosciute o con carenze della catena respiratoria, un diminuito rapporto NAA/Cr è stato visto in 11 pazienti (69%) in entrambe le regioni della materia grigia e della materia bianca ³⁰. Curiosamente, i cambiamenti nel rapporto del segnale NAA/Cr sono stati trovati solo in quei pazienti con rintracciabili picchi Lac. In alcuni studi, l'apparente diminuzione nel segnale NAA/Cr era reversibile ^38,39. Come con il Lac elevato, la

diminuzione del NAA non è specifica per la malattia mitocondriale, o persino per la malattia metabolica perché alterazioni del segnale NAA possono essere presenti anche con altri disturbi ^35,40. Comunque, ulteriori esaminazioni cliniche e biochimiche possono spesso distinguere questi disturbi dalla malattia mitocondriale primaria.
     Il segnale della colina (Cho) alla MRS è compreso in un gruppo di componenti comprese la colina libera, la fosforicolina, e la fosfatodicolina le quali costituiscono la mielina cerebrale e permettono la fluidità delle membrane cellulari ^41,42. Comunque, non è conosciuto con certezza il completo profilo dei metabolita contribuenti al segnale Cho ⁴³. L'innalzamento del Cho riflette il ricambio delle membrane e la demielinizzazione. In pazienti con una malattia mitocondriale non sono stati riportati cambiamenti del segnale Cho. Se questo rappresenti una assenza di alterazioni o la presenza di alterazioni eterogenee non è stato possibile determinarlo a causa delle piccole dimensioni dei campioni. Uno studio dimostra riduzioni nel rapporto Cho/Cr nel 40% dei pazienti con ridotto rapporto i NAA/Cr e nel 53% dei pazienti con ridotto rapporto NAA/Cr e Lac elevato ³⁰.
     Il succinato è un componente del ciclo degli acidi tricarbossilici presenti nel cervello a basse concentrazioni, nell'ordine di 0,5 mmol/kg del peso umido ⁴⁴. Nella MRS protonica, la risonanza del succinato si sovrappone a quella del glutamato e della glutamina ⁴³. In condizioni normali, il picco del succinato non è visibile alla MRS ⁴⁵. La carenza dell'attività della catena respiratoria provoca un significante aumento nella concentrazione del succinato e ne permette la sua rilevazione con la MRS. In tre pazienti con carenza del complesso II, è stato osservato un segnale molto grande del succinato insieme a ridotto NAA/Cr e aumento del segnale Lac nella materia bianca, mentre è stata vista solo una diminuzione nel rapporto NAA/Cr nella materia grigia corticale ⁴⁵. Questo evidenzia l'importanza di utilizzante una acquisizione multivoxel, o almeno usando un singolo voxel su entrambe le materie grigia e bianca nella esaminazione MRS delle malattie della catena respiratoria. Questo studio accresce anche la possibilità che un picco del succinato aumentato a 2,4 ppm possa essere specifico per le malattie del complesso II.
     La MRS protonica rappresenta un utile strumento per l'investigazione non invasiva dei disturbi neurometabolici, e in particolare nella malattia mitocondriale. Ulteriori informazioni si ottengono dalla convenzionale MRI, dato che le alterazioni metaboliche possono essere visualizzate persino in aree del cervello che appaiono strutturalmente normali. Si usa l' acquisizione convenzionale con la MRI e può essere aggiunta agli studi MRI di routine se la MRS viene richiesta in seguito ⁴⁶. Similmente ad altre modalità di investigazione per le malattie mitocondriali, l'acuità della malattia, il tipo specifico di malattia, il coinvolgimento di specifiche regioni del cervello, e la tempistica della esaminazione influenzano l'utilità dei dati registrati. In un corretto contesto, la MRS può aumentare grandemente la sensibilità della esaminazione diagnostica per le malattie mitocondriali.

Esaminazione clinica provocativa

Il carico di carboidrati con glucosio o fruttosio seguito da una serie di misurazioni del lattato plasmatico, del piruvato, e della alanina può svelare la malattia mitocondriale. Gli studi a digiuno comportano un

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aumento del rischio ma possono rivelare una tendenza verso l'ipoglicemia o verso un difetto secondario dell'ossidazione degli acidi grassi. Entrambi questi approcci diagnostici possono inoltre essere usati come aiuto nella selezione di una dieta che possa minimizzare l'acidosi lattica o piruvica. Inoltre, essi possono aiutare per confermare la sicurezza in un dato paziente di interventi standard, come le diete ad alto contenuto di grassi o chetogena ⁴⁷.
L'esaminazione con esercizio viene impiegata sempre più come esame diagnostico clinico per la miopatia mitocondriale ⁴⁸. L'ergometria alla cyclette può dimostrare una diminuzione della tolleranza all'esercizio, l'eccessiva produzione di lattato, e un lento indice di depurazione del lattato plasmatico accumulato. Inoltre, l'esame delle prestazioni dell'esercizio all'avambraccio accoppiate con la misurazione della saturazione dell'ossigeno venoso in un paziente con una malattia mitocondriale rivelerà sangue venoso ‘‘arterializzato”. Questo avviene perché la disfunzione mitocondriale nei muscoli scheletrici produce in loro l'incapacità di estrarre l'ossigeno dal sangue ^49,50.

Indagini invasive sui tessuti

La prima decisione che deve essere presa quando sono ritenute necessarie delle procedure invasive è la scelta su quale tessuto investigare per provare la disfunzione mitocondriale . La miglior scelta è il tessuto più profondamente affetto dal processo di malattia in un dato paziente ⁵¹. Sebbene la biopsia cutanea sembri preferibile alla biopsia muscolare per via della sua relativamente minore invasività, è comune per molti bambini che hanno un difetto OXPHOS rintracciabile nei muscoli scheletrici, avere una normale attività enzimatica della catena respiratoria nelle colture di fibroblasti cutanei ⁵². I muscoli scheletrici sono comunemente affetti nella malattia mitocondriale primaria. E mentre questo ha reso il tessuto dei muscoli scheletrici il tessuto più ampiamente usato per gli studi enzimatici OXPHOS, esso ha anche delle limitazioni. E' stato riportato che molti pazienti hanno difetti enzimatici rintracciabili nel fegato ⁵³ o muscolo cardiaco ⁵⁴ ma una normale attività nei muscoli scheletrici. In generale, indipendentemente dall'organo affetto, è importante eseguire una biopsia cutanea contemporaneamente alla biopsia tissutale in modo da ottenere fibroblasti coltivati per un possibile studio successivo. La discussione seguente è largamente focalizzata sulla multisfaccettata investigazione dei muscoli scheletrici, con susseguente breve panoramica sull'utilità delle analisi del cuore, fegato e fibroblasti.

Analisi dei muscoli scheletrici

La biopsia muscolare permette gli studi patologici, molecolari e biochimici. Porzioni della biopsia sono utilizzate per gli studi istochimici, immunoistochimici, e persino subcellulari per valutare le evidenze morfologiche di una malattia OXPHOS primaria, la prova di altre affezioni per la diagnosi differenziale, o alterazioni patologiche nei muscoli che potrebbero produrre anormalità secondarie nella biochimica muscolare. Il tessuto muscolare viene usato anche nelle analisi dell'attività enzimatica della catena respiratoria e negli studi di respirometria ad alta risoluzione della capacità OXPHOS integrata, per l'isolazione mitocondriale per l' esaminazione biochimica

compresa l'analisi delle attività enzimatiche e della capacità OXPHOS integrata, e per l'estrazione del DNA per l'esaminazione genetica .

Analisi Morfologica dei muscoli scheletrici

La presenza di proliferazione mitocondriale nelle miofibre è altamente indicativa di un disturbo OXPHOS mitocondriale. Tradizionalmente, questo è stato dimostrato dalla presenza di fibre rosse sfilacciate (RRF) viste alla colorazione tricromica di Gomori modificata come depositi granulari rossi di mitocondri nello spazio subsarcolemmale sullo sfondo di fibre muscolari atrofiche a vario grado. Nonostante l'importanza di queste rilevamenti nella malattia mitocondriale, le fibre rosse sfilacciate possono aversi in molti altri disturbi muscolari primari. Altre colorazioni istochimiche utili per l'analisi della attività enzimatica mitocondriale sono la NADH deidrogenasi, la succinato deidrogenasi (SDH), e la citocromo c ossidasi (COX) ^55,56. La colorazione SDH valuta il complesso II, il quale è un componente della catena respiratoria codificato interamente dai geni nucleari, e può anche identificare l'accumulazione mitocondriale subsarcolemmale. Nella comparazione, la reazione COX valuta il complesso IV, il quale è un componente della catena respiratoria codificato da entrambi i genomi mitocondriale e nucleare. Con l'applicazione sequenziale di queste due reazioni ad una singola sezione muscolare, le fibre anormali carenti di COX appariranno blu fra le fibre con attività COX normale le quali appariranno marrone. Questo approccio facilita la rilevazione di fibre anormali le quali altrimenti potrebbero rimanere non distinguibili sullo sfondo di una attività COX normale ⁵⁷.
Le RRF si vedono raramente nella fanciullezza, visto che sembra necessario del tempo per l'accumulazione mitocondriale e per raggiungere questo stadio di deteriorazione delle fibre muscolari. Le accumulazioni subsarcolemmali di mitocondri, che rappresentano una manifestazione più lieve della proliferazione mitocondriale , sono più comuni che le RRF nei pazienti pediatrici . Nonostante la presenza di precisi rilevamenti, la proliferazione mitocondriale era assente nel 35% dei 113 pazienti pediatrici con provata disfunzione mitocondriale ⁵⁸. Specialmente nei bambini, le fibre carenti di COX talvolta sono più numerose delle RRF e possono essere il solo rilevamento anormale nella biopsia muscolare [59]. Nessuna delle due, né la presenza delle RRF, né la perdita focale della attività COX è specifica della malattia. Piuttosto, esse possono apparire nei muscoli scheletrici come un fenomeno collegato all'età o come un fenomeno secondario infrequentemente visto in altri disturbi come le distrofie muscolari, la distrofia miotonica, le miopatie infiammatorie, la glicogenosi, e le miopatie congenite ⁵⁹. Altre caratteristiche patologiche le quali possono essere viste nei muscoli scheletrici nei disturbi OXPHOS sono ancora meno specifiche, compresa l'atrofia neurogena, nuclei interni, anormali variazioni nelle dimensioni delle fibre, e le accumulazioni di glicogeno o di lipidi ^60,61. La colorazione per glicogeno e lipidi rimane importante per valutare i disturbi primari dell'accumulo di glicogeno o lipidi. La rabdomiolisi e le alterazioni distrofiche sono rare nei disturbi OXPHOS mitocondriali.

La presenza di RRF aventi una forte attività SDH subsarcolemmale e bassa attività COX è tipica di disturbi dovuti a delezioni del mtDNA (cioè, Sindrome di Kearns-Sayre o oftalmoplegia esterna progressiva (PEO)) o mutazioni del tRNA (cioè, epilessia mioclonica e fibre rosse

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sfilacciate (MERRF)) le quali danneggiano la sintesi delle proteine mitocondriali ⁵⁸. La carenza di COX si ha quando i livelli del mtDNA di tipo selvatico scendono sotto la soglia necessarie per l'espressione delle proteine delle subunità COX. Può non essere presente nessuna o solo alcune fibre carenti di COX a dispetto della alta percentuale di mutazioni nel mtDNA se c'è una distribuzione uniforme di mtDNA di tipo mutante e di tipo selvatico in ogni parte della fibra. Un esempio di questo è la MELAS classica dovuta alla mutazione A3243G del gene tRNA^Leu nella quale le RRF sono spesso COX-positive. Nella MELAS si vede frequentemente un aumento nella attività della SDH nella muscolatura liscia vascolare ⁶².
     Un modello a mosaico e segmentale dell'attività COX è altamente indicativo di un disturbo eteroplasmico del mtDNA. In contrasto, una globale diminuzione dell'attività di COX diffusa nella lunghezza delle fibre muscolari è solitamente indicativa di una mutazione in un gene nucleare codificante una delle proteine necessarie per l'assemblaggio e la funzione COX, come il SURF1. Comunque, un modello simile può essere osservato in alcuni pazienti presentanti mutazioni omoplasmiche del tRNA. Se l'attività COX è diffusamente diminuita ma risparmia i fusi muscolari e la muscolatura liscia vascolare, le considerazioni diagnostiche devono includere entrambe le forme fatale e benigna della miopatia infantile da carenza di COX ⁶³. Le mutazioni nei geni codificanti proteine del mtDNA sono occasionalmente associate con RRF ma hanno fibre COX-positive (a meno che i geni COX stessi non siano il sito della mutazione). Questo è il caso dei disturbi associati con mutazioni nel citocromo b, COX I–III, e alcune mutazioni nei geni del complesso I (ND1-6, ND4L). Al contrario, le mutazioni associate con la NARP/MILS (mutazione T8993G/C nel gene mtDNA per l'ATPasi 6) e le mutazioni ND associate con la LHON solitamente non rivelano nessuna alterazione specifica alla biopsia muscolare.
     La miopatia mitocondriale è infrequente nei disturbi OXPHOS dovuti a mutazioni nel nDNA e solitamente non si vede in associazione con le mutazioni nelle subunità codificate dal nucleo dei complessi I e II, le quali sono spesso ma non esclusivamente associate con la sindrome di Leigh. Eccezioni sono alcuni pazienti con adPEO, disturbi da deplezione nel mtDNA, e forme miopatiche da carenza di CoQ₁₀, come pure nelle prime biopsie da bambini con la forma benigna della miopatia infantile da carenza di COX ⁶⁴.
     Sugli studi con la microscopia elettronica delle alterazioni ultrastrutturali nei muscoli è stato dibattuto da alcuni autori riguardo il loro valore nella esaminazione diagnostica delle miopatie mitocondriali ⁵⁸. Sebbene caratteristiche anormalità ultrastrutturali come l'aumento di numero o dimensioni dei mitocondri, creste assenti o distorte, e inclusioni paracristalline o osmofiliche siano ben documentate in pazienti con disturbi mitocondriali ⁶⁵, queste alterazioni non sono specifiche e possono essere viste in altre malattie miopatiche e neuropatiche ⁶⁰. Comunque, la microscopia elettronica può identificare mitocondri strutturalmente anormali quando l'istochimica non è di aiuto. Alterazioni ultrastrutturali dei mitocondri sono state descritte in biopsie muscolari di pazienti che non hanno RRF o fibre carenti di COX ⁶⁰.

Analisi biochimiche dei muscoli scheletrici
     Solamente una piccola proporzione di bambini investigati per un sospetto disturbo mitocondriale hanno una classica presentazione sindromica (cioè, la sindrome di Kearns-Sayre , la sindrome di Pearson, la sindrome di Leigh, la MELAS, la MERRF, o la LHON). Inoltre, il quadro clinico di un paziente pediatrico è raramente specifico per un singolo difetto genetico e l'istologia muscolare è più frequentemente normale o mostra solo alterazioni non specifiche ⁵¹. E' stato stimato che più di 1000 geni siano coinvolti nell'appropriato funzionamento del mitocondri, molti dei quali hanno non sono stati ancora caratterizzati negli esseri umani ⁶⁶. Tutto questo preso insieme, rende generalmente lo studio biochimico del tessuto un prerequisito per ulteriori dirette indagini molecolari genetiche nella malattia mitocondriale pediatrica.
     Le indagini biochimiche includono solitamente le analisi spettrofotometriche della attività enzimatica come pure studi funzionali su mitocondri intatti, ciascuno dei quali fornisce utili e complementari indicazioni per la diagnosi di un disturbo OXPHOS ⁶⁷. La misurazione delle attività enzimatiche con metodi spettrofotometrici può essere condotta su mitocondri isolati da tessuti o colture cellulari, in tessuto omogenato, o in cellule intere. I dati spettrofotometrici danno preziose informazioni riguardo le massimali attività enzimatica delle componenti catalitiche dei vari complessi respiratori seguendo o la demolizione delle membrane mitocondriali interne con detergenti o tramite congelamento–scongelamento e sono generalmente abbastanza facili da riprodurre e interpretare entro un dato laboratorio ^68,69. Sfortunatamente, non c'è una standardizzazione universalmente accettata per queste analisi o condizioni di analisi, ed è comune una variabilità dei risultati degli esami fra differenti laboratori. In verità, un recente programma di scambio di campioni fra laboratori europei ha rivelato ampie variazioni nei risultati delle analisi sugli stessi campioni ⁵. Un'altra importante limitazione è che l'attività viene determinata nelle condizione in vitro, la quale non corrisponde all'ambiente fisiologico e citosolico dei mitocondri.
     Le attività basate sulla spettrofotometria dei differenti complessi enzimatici della catena di trasporto degli elettroni (ETC) possono essere studiate isolatamente come complesso I (NADH–ubichinone ossidoriduttasi), complesso II (succinato-ubichinone ossidoriduttasi), complesso III (decilubichinone–citocromo c riduttasi) o complesso IV (citocromo c ossidasi), o possono essere studiati assieme come complesso I + III (NADH–citocromo c riduttasi) o complesso II + III (succinato-citocromo c riduttasi). Sebbene non vengano effettuate spesso di routine, le analisi dirette della attività idrolitica della ATP sintetasi (complesso V) sono disponibili per mezzo di analisi spettrofotometriche ²². Per aiutare a distinguere i difetti primari della catena di trasporto degli elettroni dalle carenze secondarie, le misurazioni dell'attività sono riportate relativamente ad un enzima marcatore, come la citrato sintetasi, o come rapporti interni piuttosto che relativi alla concentrazione delle proteine ^52,69,70. Queste analisi possono produrre una ampia gamma di risultati in pazienti con disturbi OXPHOS mitocondriali, con alcuni campioni di pazienti mostranti una normali attività enzimatiche della ETC. Questo apparente paradosso può derivare dal fatto che per le analisi si usano substrati artificiali in preparazioni di mitocondri disgregati, per la comparazione con la respirazione di mitocondri

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cellulari intatti che trova luogo in un ambiente stereochimico di complessi multi-enzimatici e supercomplessi. Inoltre, l'alta variabilità biologica di queste analisi può rendere chiara l'identificazione di una singola difficoltà da carenza. Comunque, difetti isolati coinvolgenti un complesso possono suggerire una mutazione o in una subunità codificata dal mtDNA o codificata dal nDNA o in fattori di assemblaggio di un particolare complesso (cioè, mutazione SURF1 nella carenza di COX). Le carenze enzimatiche parziali coinvolgenti i complessi I, III e IV sono tipiche dei pazienti con un difetto di transazione generalizzato dovuto a delezioni del mtDNA o mutazioni del tRNA ^71,72. Difetti enzimatici multipli si vedono anche nei difetti della polimerasi mitocondriale. Esistono delle eccezioni, come l'attività del complesso I che può essere preferenzialmente diminuita nei muscoli di pazienti con la MELAS e l'attività COX che può essere preferenzialmente diminuita in pazienti con la MERRF, MELAS e nella carenza della polimerasi mitocondriale. Le misurazioni combinate dei I + III e dei II + III forniscono utili informazioni per la diagnosi dei disturbi potenzialmente trattabili da carenza di coenzima Q₁₀ o dei disturbi che colpiscono il legame del CoQ_{10 o}o lo scambio di elettroni, i quali possono successivamente essere confermati con la quantificazione del coenzima Q₁₀ nei muscoli ^73,74.

Gli studi polarografici misurano il consumo di ossigeno attraverso mitocondri muscolari isolati usando un elettrodo Clark in presenza di vari substrati (per es., malato + piruvato o malato + glutamato per donare NADH, succinato per donare FADH2, duroidrochinone per donare elettroni direttamente al complesso III, o TMPD + ascorbato per donare elettroni direttamente al citocromo c) ^61,70. In pazienti con carenza del complesso I, si rileva una respirazione insufficiente con substrati producenti NADH mentre i rapporti di ossidazione in presenza del altri substrati sono normali. I pazienti con carenza del complesso II mostrano un ridotto consumo di ossigeno solo con substrati producenti FADH₂. Bassi rapporti respiratorio con substrati producenti sia NADH- che FADH₂ ma una normale ossidazione del duroidrochinone e TMPD + ascorbato suggeriscono una carenza di coenzima Q₁₀, laddove bassi rapporti respiratori con entrambi i substrati producenti NADH- e FADH₂ con una bassa ossidazione del duroidrochinone suggeriscono una carenza del complesso III. Diminuiti rapporti di ossidazione in presenza di tutti i substrati esaminati è indicativa di una carenza del complesso IV. Inoltre, gli studi polarografici possono indicare una possibile carenza del complesso della piruvato deidrogenasi (PDHC) con il rilevamento di una ridotta ossidazione del piruvato in presenza di una normale ossidazione del glutamato ⁷⁵.

Un altro mezzo di misurazione della funzione della catena respiratoria è usare substrati marcati radioattivamente (per es., il piruvato [1^-14C], il malato [U-¹⁴C] ed il succinato [1,4-¹⁴C]) in assenza o presenza di vari inibitori per misurare produzione di ¹⁴CO₂ e ATP in relazione all'attività della citrato sintetasi come marcatore del capacità mitocondriale . Nell'intento di trovare il punto preciso della carenza in un singolo complesso della catena respiratoria possono essere determinati vari rapporti. In laboratori con esperienza, questo è un approccio eccellente e molto esatto ⁷⁶.

Nell'intento di misurare i mitocondri muscolari nel loro ambiente fisiologico e per minimizzare le dimensioni del campione, è stato sviluppato un metodo usando fibre muscolari permeabilizzate. Singole fibre muscolari vengono rese permeabili con saponina e collocate in una camera polarografica ad alta-risoluzione dove possono essere aggiunti vari substrati (come sopra) per quantificare le velocità del consumo di ossigeno. Cinquanta mg. di muscolo sono sufficienti per analisi multiple con fino a sette differenti substrati. Originalmente, i risultati venivano espressi normalizzati al peso umido delle fibre muscolari, sebbene alcuni investigatori avessero trovato che questo approccio non fosse sensibile per la ossidazione di substrati marcati radioattivamente nella diagnosi delle carenze della catena respiratoria (Wolf NI, risultati non pubblicati). Ha ancora da essere dimostrato se questi risultati potranno essere migliorati in confronto ad una delle tecniche affermate, con l'uso della citrato sintetasi come enzima di riferimento ⁷⁷.

Mentre il tessuto muscolare fresco è ampiamente considerato preferibile per le analisi biochimiche, per via di molti fattori compresa la costrizione geografica, frequentemente ci si deve limitare al muscolo congelato. Una biopsia muscolare fresca ha il vantaggio che permette di condurre studi funzionali integrati con vari metodi su mitocondri isolati, come la misurazione del consumo dell'ossigeno con la polarografia, l'ossidazione di substrati, o i tassi di produzione di ATP. Inoltre, la respirometria ad l'alta risoluzione di fibre muscolari permeabilizzate offre l'opportunità di usare la polarografia nello studio di campioni freschi, da campioni ottenuti da biopsie muscolari intatte tramite agobiopsia di muscolo o di fegato che pesano meno di 2 mg ^78,79. Tutti questi studi funzionali danno la possibilità di valutare l'attività integrata di tutti i complessi del sistema OXPHOS sia nelle cellule permeabilizzate intatte ⁷⁸ che nei mitocondri isolati sotto condizioni che sono molto più simili alle situazioni in vivo di quelle che sono le analisi enzimatiche isolate della ETC ^80,81. Questo tipo di misurazioni può anche identificare difetti mitocondriali che non sono rintracciabili con le analisi enzimatiche della ETC su campioni congelati ^82,83. Gli esami polarografici permettono l'identificazione di difetti del coenzima Q₁₀ sintetico, che si vedono dalla bassa utilizzazione dell'ossigeno da parte di entrambi i substrati producenti NADH e FADH- ^84,85. Gli studi funzionali possono anche rivelare anormalità nella carenza di PDHC, negli enzimi del ciclo degli acidi tricarbossilici, nella beta-ossidazione, nei coenzimi, nel complesso V, e nei portatori transmembranali ⁵¹. Sicuramente, la carenza di due differenti trasportatori di membrana mitocondriali coinvolgenti i portatori del piruvato e del fosfato è stata dimostrata usando le misurazioni funzionali in muscolo fresco ^86,87. In un recente studio, il 30% dei pazienti con anormali studi funzionali su mitocondri freschi avevano una normale attività dei singoli enzimi; questo sarebbe sfuggito se fossero stati studiati solo su muscolo congelato ⁷⁶.

Coenzima Q₁₀ quantificazione
Il coenzima Q₁₀ serve per molteplici funzioni intracellulari di ossido-riduzione, con un ruolo importante nel trasporto mitocondriale degli elettroni come portatore mobile di elettroni per spolettare elettroni al complesso III dai complessi I, II, fattore di trasferimento degli elettroni (ETF), o ad altri donatori di elettroni. Ha anche funzioni pro-ossidanti ⁸⁸, come pure la capacità di riciclare altri

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antiossidanti compreso il tocoferolo e l'ascorbato. Della principale carenza di coenzima Q₁₀, la quale deriva da carenze negli enzimi necessari per la sua sintesi, si conoscono attualmente quattro fenotipi: (i) encefalomiopatia con intolleranza all'esercizio, miopatia, mioglobinuria, attacchi epilettici, e atassia, (ii) encefalopatia infantile grave con tubulopatia renale, (iii) forma miopatica con intolleranza all'esercizio, miopatia, e rabdomiolisi, e (iv) encefalopatia con atassia, attacchi epilettici, e malattia dei gangli basali ^89,90. Mentre la carenza primaria di questi cofattori critici causa questi seri disturbi, la carenza primaria di coenzima Q10 è rara. In aggiunta ai rilevamenti clinici, la stesura di questa diagnosi richiede la rilevazione di insufficiente attività della catena respiratoria dipendente dal Q₁₀ ed una riduzione dei livelli del Q₁₀ tessuto-specifica. I livelli plasmatici del coenzima Q₁₀ sono solitamente normali nella carenza muscolare primaria di coenzima Q₁₀. La carenza secondaria di coenzima Q₁₀ nei muscoli è stata riportata per la prima volta assieme con una risposta al trattamento nel 1986 nella sindrome di Kearns-Sayre ⁹¹. Da allora si sono accumulate prove in numerosi studi che una fetta di pazienti con una malattia mitocondriale ha carenza muscolare di coenzima Q₁₀ ⁹².

La concentrazione di coenzima Q₁₀ varia grandemente nei tessuti, con il muscolo cardiaco avente il più alto contenuto a 114 μg/g ⁹³. Le analisi per il coenzima Q₁₀ nel plasma umano sono state rese disponibili nei laboratori commerciali da più di un decennio. Le gamme dei controlli nel plasma variano fra laboratori ⁹⁴. Poichè il coenzima Q₁₀ è primariamente legato alle lipoproteine, il coenzima Q₁₀ libero è relativo alla concentrazione del colesterolo, con valori normativi stabiliti in funzione dell'età ⁹⁵. Le concentrazioni del coenzima Q₁₀ nei muscoli scheletrici in un bambino sano sono stati riportati in una dupplice gamma ⁹⁶. I leucociti (e/o linfociti) e le piastrine sono altri tessuti nei quali il coenzima Q₁₀ può essere misurato, e può riflettere più accuratamente, comparato con i livelli plasmatici, la vera concentrazione tissutale del coenzima Q₁₀. In uno studio condotto su 12 campioni di controllo e un paziente carente è stata dimostrata una buona correlazione fra i livelli del coenzima Q₁₀ nei globuli bianchi mononucleari del sangue e quello nei muscoli ⁹⁴.

Analisi del muscolo cardiaco

Sia nelle cardiomiopatie ipertrofiche che in quelle dilatative sono stati descritti una varietà di difetti nella fosforilazione ossidativa mitocondriale ^97,98. In alcuni casi, la cardiomiopatia dilatativa riflette meramente un percorso finale comune di insufficienza della pompa originata da molte differenti cause, compresa la cardiomiopatia ipertrofica. La dilatazione delle camere, con il conseguente aumento della tensione parietale, rappresenta una comune risposta fisiologica finale all'equilibrio fra l'emissione cardiaca e la pressione del sangue attraverso i principi dell'equilibrio di Laplace (pressione– volume) e Frank-Starling (tensione parietale-forza). La maggior parte dei pazienti hanno disfunzioni multisistemiche con cardiomiopatia isolata raramente descritta ^70,99. Ciò che è difficile da provare è in quali pazienti la disfunzione mitocondriale è primaria o secondaria all'insufficienza cardiaca ^100,101.

Numerosi studi hanno dimostrato disfunzione mitocondriale sia nell'invecchiamento cardiaco che nella malattia cardiaca ^102,103. Pertanto, la biopsia muscolare cardiaca può rivelare difetti della catena respiratoria che sono secondari alla primaria insufficienza vascolare meccanica o coronarica . Solamente associandovi l'esaminazione dei muscoli scheletrici o di altri tessuti affetti per difetti della catena respiratoria si può capire se i difetti OXPHOS possono essere primari o secondari ⁹⁸. In un neonato malato gravemente, un infante o bambino giovane, la diretta esaminazione genetica può essere di aiuto quando le condizioni precludono la biopsia come nelle mutazioni in SCO2, COX-10, e COX-15 che possono portare a ipertrofia cardiaca. Studi su animali suggeriscono che entrambe le differenze quelle strutturali e quelle della catena respiratoria possono essere collegate alla localizzazione intermiofibrillare e subsarcolemmale dei mitocondri cardiaci ^102,104. L'aumento delle riuscite nell'identificazione dei difetti della catena respiratoria dovrebbe perciò includere l'isolazione dei mitocondri intermiofibrillari e subsarcolemmali per gli esami. Dato l'alto rapporto di disfunzione mitocondriale nella malattia cardiaca, l'anormalità isolata derivata solamente dal tessuto cardiaco deve essere vista con cautela.

Analisi del fegato

Se la disfunzione epatica è clinicamente evidente e viene presa in considerazione la diagnosi di malattia mitocondriale epatica o epatocerebrale, la valutazione iniziale meno invasiva è l'esaminazione del DNA nel sangue per le mutazioni POLG, dGUOK, o MPV17. Sebbene meno comuni, possano anche essere prese in considerazione, le mutazioni SCO1 e SUCLA2 se è presente anche chetoacidosi (SCO1) o miopatia (SCO1 e SUCLA2) (Tabella 1). Una biopsia epatica è indicata sia se la diagnosi non può essere stabilita con questi iniziali studi del DNA o se la gravità clinica della malattia epatica richiede simultaneamente la biopsia e gli studi del DNA. Gli studi del DNA possono richiedere fino a 2 mesi per i risultati, laddove una biopsia può produrre risultati istologici in pochi giorni. L'agobiopsia tipicamente preleva sufficiente tessuto per l'istologia, la microscopia elettronica, e la polarografia ad alta risoluzione della catena respiratoria e per la biochimica sugli omogenati.

La malattia mitocondriale può produrre una ampia gamma di istologie epatiche anormali ^105,106. L'esaminazione biochimica della carenza isolata di COX nella catena respiratoria può essere vista nelle malattie causate da ognuno dei 5 geni nucleari sopra elencati. Carenze multiple della ETC possono essere viste con le deplezioni nel mtDNA associate con le mutazioni POLG, dGUOK, MPV17, o SUCLA2. Le analisi Southern quantitative o la PCR quantitativa in tempo reale devono essere una parte della routine della esaminazione della biopsia epatica per rivelare deplezioni nel mtDNA. Comunque, è necessario un mondo di cautela. Similmente al caso dell'l'interpretazione del lattato ematico, è di aiuto sapere se il mtDNA è depleto, ma un risultato normale non fornisce nessuna informazione pro o contro la malattia mitocondriale. Per esempio, è comune avere un normale contenuto di mtDNA nelle biopsie ottenute all'inizio del decorso della malattia POLG, come nella presentazione della sindrome di Alpers, mentre ripetendo l'esame su biopsie ottenuto successivamente, nella naturale storia della malattia, esse mostreranno la deplezione ¹⁰⁷.

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Tabella 1

Dettagliata compilazione di rilevamenti biochimici e clinici associati con mutazioni patogene in geni del DNA nucleare attualmente implicati in malattie mitocondriali primarie

Suggestive

laboratorio-basato

rilevamenti

nDNA Gene(s)a

Gene funzione

Le più comuni manifestazioni cliniche

Esaminazione genetica clinicamente disponibile?

Anormalità dei gangli basali

(simil-Leigh)

Leuco-encefalo-patia

Attacchi epilettici

Atassia

Neuro-patia

Cardio-miopatia

Miopatia

Malattia epatica

malattia

Malattia renale

Atrofia ottica

Coinvolgimento dei muscoli extra oculari

Perdita dell'u-dito ^b

Altri

NDUFS1,
NDUFS3,
NDUFS6,
NDUFS8,
NDUFV2

NDUFS2,
NDUFS4,
NDUFS7,
NDUFV1,

CI strutturali

subunità

B17.2L,

NDUFAF1

CI assemblaggio

chaperoni

Carenza del complesso II

SDHA

subunità strutturali del CII

SDHB, SDHC,

SDHD

Paragangliomi,

feocromocitomi,

Cowden e Cowdenlike

sindrome

Carenza del complesso III

carenza; sovraccarico di ferro

BCS1L

Assemblaggio del CIII

GRACILE (ritardo nella crescita,

aminoaciduria,

colestasi, sovraccarico di ferro, acidosi lattica, e morte precoce); Bjornstad

sindrome

Carenza del complesso IV

SURF1

Assemblaggio del complesso IV

SCO1

Incorporazione di rame

SCO2

Incorporazione di rame

COX10

Sintesi del heme

COX15

assemblaggio del complesso IV

Riportato in 2 casi

ETHE1

Mitocondriali matrice

proteine

Petecchie ricorrenti,

cronico diarrea,

acrocianosi ortostatica,

etilmalonico aciduria,

cronico lattica

acidosi, " C4- e C5

acilcarnitina

LRPPRC (LSFC)

mRNA

processante il complesso IV

Carenza del complesso V

ATP12

assemblaggio del complesso V

Riportato in 1 caso

Coenzima Q10

carenza,

complesso I–

III + II–III

carenza

PDSS1

Coenzima Q

biosintesi

Mental retardation;

vascolopatia

PDSS2

COQ2

APTX (apratassina)

Singole stranded break

repair

Oculomotor aprassia

ADCK3

Protein chinasi

ETFDH

Electron-transferring-flavoprotein

deidrogenasi

Elevated CPK, lipidi

accumulazione in

muscle; allelic

disturbo to glutaric

aciduria tipo II

Multiple ETC enzyme

carenza

TSFM

Mitocondriali

translation

TUFM

Polimicrogiria,

riportati in 1 caso

EFG1

Riportato in 1 caso

MRPS16

Riportato in 1 caso;

agenesi del corpo calloso, dismorfica

PUS1

Pseudouridina

sintetasi

MLASA (miopatia,

acidosi lattica, e

anemia sideroblastica)

DARS2

Mitocondriali

aspartil-tRNA

sintetasi

LBSL

(leucoencefalopatia

con cervello stem e

spinal cord

coinvolgimento e

lattato innalzamento),

atassia cerebellare,

spasticità, dorsal

colonna segni

Piruvato

deidrogenasi

carenza

PDHA1 (alfa

subunità of PDC)

Piruvato metabolismo

Altri PDH complessa

geni

Piruvato metabolismo

deplezione nel mtDNA

con respiratoria

catena disfunzione

(may presenti as

isolato complessa

IV carenza o as

multi-complessa

carenze con

o senza

mtDNA

deplezione)

POLG1 (mtDNA

gamma polimerasi)

mtDNA replicazione

Alpers, PEO, Atassia

Neuropatia Spectrum

(ANS), tirosinemia,

can presenti con

deplezione nel mtDNA

e/o multiple ETC

carenze

TK2 (timidina

chinasi)

Nucleotide salvage

Elevated CPK

DGUOK

(desossiguanosina

chinasi)

Nucleotide salvage

tirosinemia

MPV17

Sconosciuta

(mitocondriale membrane interne proteine)

Giant mitocondri,

lipidi droplets in

muscle, tirosinemia

SUCLA2

ADP-forming

succinil-coA

sintetasi

Lieve acidemia metilmalonica

SUCLG1

Succinato-coA ligasi

Riportato in 1

pedigree

RRM2B

p53-regulated

ribonucleotide

riduttasi piccole

subunità

Riportato in 3

linee ereditarie; ipotonia,

acidosi lattica, COX

negative fibre in 1

famiglia

mtDNA multiple

delezioni

TWINKLE (mtDNA

elicasi)

mtDNA replicazione

POLG1 (mtDNA

gamma polimerasi)

mtDNA replicazione

Alpers, PEO, Atassia

Neuropatia Spectrum

(ANS), tirosinemia,

can presenti con

multiple mtDNA

delezioni e/o

multiple ETC

carenze

ANT1/SLC25A4

Adenina nucleotide

traslocasi

Anemia sideroblastica

ABC7

Esportazione del ferro

Riportato in 3

linee ereditarie; anemia sideroblastica collegata a X

" Timidina e

desossiuridina; ; WBC

timidina

fosforilasi

ECGF1 (Timidina

fosforilasi)

Nucleotide salvage

Dismotilità gastrointestinale, MNGIE

Nessuno

FXN (Fratassina)

Accumulo di ferro

Diabete mellito,

atassia di Friedrech

OPA1

mtDNA mantenimento

(dinamina famiglia

GTPase)

DDP1

Mitocondriali

transporter

Distonia, perdita di visione, sindrome Mohr-Tranebjaerg, sindrome distonia sordità collegata a X

SPG7 (Paraplegina)

Metalloproteasi

Paraplegia spastica ereditaria

TAZ (Tafazzina)

Sconosciuta

(mitocondriale

membrane proteine)

Neutropenia,

aciduria metilglutaconica , sindrome di Barth

Note:

^a Subunità strutturali del complesso I ¹⁵¹, B17.2L e NDUFAF1 ¹⁵¹, SDHA ¹⁵², SDHB, SDHC , e SDHD ¹⁵³, BCS1L ^154,155, SURF1 ¹⁵⁶, SCO1 ¹⁵⁷, SCO2 ¹⁵⁸, COX10 ¹⁵⁹, COX15 ^160,161, ETHE1 ¹⁶², LRPPRC (LSFC) ¹³⁸, ATP12 ¹⁶³, PDSS1 ¹⁶⁴, PDSS2 ¹⁶⁵, COQ2 ¹⁶⁴, APTX ¹⁶⁶, ADCK3 ¹⁶⁷, ETFDH ¹⁶⁸ TSFM ¹⁶⁹, TUFM ¹⁷⁰, EFG1 ¹⁷⁰, MRPS16 ¹⁷¹, PUS1 ¹⁷², DARS2 ¹⁷³, PDHA1 ¹⁴, POLG1 ¹⁰⁷, TK2 ^174,175, DGUOK ¹⁷⁶, MPV17 ¹³⁷, SUCLA2 ¹⁷⁷, SUCLG1 ¹⁷⁷, RRM2B ¹⁷⁸, TWINKLE ¹⁷⁹, ANT1 ¹⁸⁰, ABC7 ¹⁸¹, ECGF1 ¹⁸⁸, FXN ¹⁸², OPA1 ¹⁸³, DDP1 ¹⁸⁴, SPG7 ^185,186, TAZ ¹⁸⁷.

^b La perdita di udito neurosensoria (più comunemente localizzata nel centrale tronco cerebrale o periferico cocleare in pazienti pediatrici e adulti, rispettivamente) può essere vista virtualmente in ogni malattia mitocondriale, sebbene essa raramente rappresenti una sofferenza.

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Analisi dei fibroblasti

Una biopsia cutanea è frequentemente utile nella esaminazione diagnostica della malattia metabolica. Questa semplice procedura ambulatoriale può essere fatta con l'anestesia locale (sia con crema anestetica topica locale o con l'iniezione intradermica di un anestetico locale) usando un disponibile stampino monouso da biopsia di 3 o 4 mm, senza la necessità di suturare. Questo contrasta nettamente con una biopsia muscolare, la quale è una procedura invasiva che richiede sedazione, se non l'anestesia generale. I fibroblasti hanno una lungo elenco di utilità nello studio della biochimica della malattia mitocondriale ¹⁰⁸. Un beneficio ulteriore delle colture di fibroblasti cutanei è che esse possono essere conservate indefinitamente, e usate come una rinnovabile fonte di DNA, e ricoltivati per le esaminazioni via via che diventano possibili nuovi esami ^109,110. Lo svantaggio maggiore è che non tutti i fenotipi mitocondriali sono espressi nei fibroblasti cutanei ^6,109. Sfortunatamente, i fibroblasti non sono utili come lo sono i muscoli come tessuto nel quale identificare la malattia mitocondriale poiché i difetti della catena respiratoria espressi nel tessuto muscolare possono non essere espressi nei fibroblasti. Questo è dovuto in parte alla alterata eteroplasmia e all'alto tasso di rigenerazione tissutale dei fibroblasti se comparato con le cellule muscolari ¹⁰⁹. E' importante coltivare i fibroblasti in presenza di uridina e piruvato per evitare la potenziale perdita di cellule portatici di mtDNA mutante ¹¹¹. L'attività enzimatica residua della ETC nei fibroblasti è spesso sostanziale – persino nei casi geneticamente provati di malattia mitocondriale ⁶. Con l'ulteriore preoccupazione per la variabilità inter- e intra-laboratorio, specialmente per gli esami dell'attività enzimatica del complesso I, le analisi degli enzimi della ETC nei fibroblasti hanno un alto tasso di falsi-negativi. Perciò, una assenza di difetti nelle analisi biochimiche dei fibroblasti non esclude un disturbo del metabolismo mitocondriale . E disponibile una eccellente rassegna dell'utilità e delle indicazioni per gli studi sui fibroblasti per la diagnosi mitocondriale ¹⁰⁹.
L'esaminazione biochimica delle colture di fibroblasti cutanei, la quale può essere informativa, include l'analisi degli enzimi della catena di trasporto degli elettroni via spettrofotometria e studi sull'ossidazione degli acidi grassi con isotopi radiomarcati. Ulteriori esaminazioni possono includere le misurazioni del lattato e piruvato ¹¹⁰. La produzione ed il consumo di ATP possono essere studiate nei fibroblasti ¹¹², sebbene l'analisi dell'ATP sia più affidabile nei linfoblasti ¹¹³. I fibroblasti possono anche fornire eccellente materiale per studi sulle proteine, comprese le analisi del western blot e l'elettroforesi al blu nativo su gel poliacrilamidico (BNPAGE) ¹¹⁴. La BN-PAGE permette l'analisi delle multisubunità, e dei complessi di proteine integrali delle membrane come quelli dei complessi per il trasporto mitocondriale degli elettroni. E' usata per identificare anormalità nell'assemblaggio dei complessi come i difetti del SURF1 ¹¹⁵ o i difetti di traslazione mitocondriale tessuto-specifici ¹¹⁶. Ulteriori anormalità possono essere rilevate se si conduce una BN-PAGE/SDS–PAGE bidimensionale in combinazione con le analisi Western usando anticorpi rivolti a proteine di speciale interesse ^117,118.

Esaminazione diagnostica genetica

Analisi del DNA mitocondriale

L'esecuzione di una approfondita analisi del DNA mitocondriale necessita di capire la portata dei tipi di mutazioni del DNA mitocondriale, i relativi meriti e gli inconvenienti dei vari metodi analitici disponibili, e l'appropriato tessuto per l'esaminazione di un dato paziente. I tipi di anormalità del DNA mitocondriale che possono essere causativi di malattia mitocondriale umana comprendono le mutazioni puntiformi di una singola coppia di basi, inserzioni o delezioni di numerose coppie di basi, delezioni a grande scala dell'ordine di 100aia a 1000aia di coppie di basi, o una deplezione relativa alla totalità del DNA mitocondriale contenuto. I metodi di laboratorio che possono essere usati per vagliare le mutazioni puntiformi conosciute includono l'analisi PCR con polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP) per vagliare le specifiche mutazioni su una singola coppia di basi, o l'analisi multiplex PCR con analisi oligonucleotidi allele-specifico (ASO) per vagliare simultaneamente le mutazioni multiple conosciute. I metodi che possono essere usati per la vagliatura di mutazioni puntiformi sconosciute del mtDNA includono il polimorfismo conformazionale a singolo filamento (SSCP) ¹¹⁹, le analisi di screening degli eteroduplici (come l'elettroforesi su gel a gradiente di temperatura temporale (TTGE) ^120–122, l'elettroforesi su gel a gradiente di temperatura (TGGE) ¹²³, l'elettroforesi su gel a gradiente denaturante (DGGE) ^124,125, la cromatografia liquida denaturante ad alta prestazione (dHPLC) ¹²⁶), e la sequenziazione. Come la diretta sequenziazione del DNA è generalmente considerata essere lo standard d'oro per la rilevazione delle mutazioni nei geni nucleari, l'avvento di strumenti per la sequenziazione rapida ha portato alcuni laboratori a comprendere la sequenziazione del mtDNA nel loro approccio diagnostico clinico con una delle numerose differenti metodologie di sequenziazione disponibili. L'interferenza di pseudogeni nucleari dovrebbe essere esclusa con l'uso di cellule rho^o durante le analisi basate sullo sviluppo di nuove analisi basate su PCR. Le mutazioni o delezioni puntiformi possono non essere presenti in tutti genomi del mtDNA entro una cellula o un tessuto, a seconda del vario grado di presenza eteroplasmica con il tipo selvatico. La sensibilità dei differenti metodi analitici per la rilevazione delle mutazioni omoplasmiche o eteroplasmiche è un fattore guida nella determinazione della loro utilità relativa. La quantificazione dell'eteroplasmia mutante può essere condotta con la scannerizzazione densitometrica utilizzante la RFLP o la ARMS qPCR ¹²⁷ in tempo reale. L'analisi Southern blot è il metodo usato più spesso per la rilevazione delle delezioni e delle duplicazioni del mtDNA a grande-scala e, sebbene queste possano anche essere rilevate con l'analisi della reazione a catena della polimerasi a grande-scala (PCR). Infine, l'esaminazione per le deplezioni utilizzante o la scannerizzazione densitometrica Southern o la qPCR in tempo reale per quantificare il numero delle copie del mtDNA in riferimento ad un gene nucleare ¹²⁷. Una completa discussione dei relativi meriti e gli inconvenienti di ognuna di queste analisi è disponibili su www.mitosoc.org.

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Analisi del DNA nucleare

Una stima del 75–90% delle malattie mitocondriali pediatriche primarie deriva da mutazioni nel nDNA ⁴. La capacità di identificare una mutazione genetica causativa in un dato paziente ha aumentato sostanzialmente la capacità di diagnosi definitiva di una malattia mitocondriale primaria. Quando i classici sintomi della malattia mitocondriale creano un alto indice di sospetto ¹, o l'acuità del paziente limiti un approccio passo-passo, si può talvolta procedere direttamente alla esaminazione del DNA senza avere perseguito una ampia esaminazione basata sulla biochimica per una guida diagnostica preliminare. La figura 4 fornisce un esempio di algoritmo di come un laboratorio di clinica molecolare approccia le analisi basate sul DNA nella malattia mitocondriale (cortesia di L.-J. Wong). Comunque, è spesso prudente usare l'esaminazione biochimica per fornire sufficienti informazioni per guidare nella scelta della esaminazione genetica diagnostica da perseguire. La tabella 1 fornisce una dettagliata panoramica di come i risultati delle indagini basate sul laboratorio possano suggerire specifici geni

nucleari fra quelli implicati nella malattia mitocondriale da dare come possibili candidati patogenici in un dato paziente.

E' necessaria una regolare riconsiderazione dell'evoluzione dei segni e sintomi clinici. I disturbi mitocondriali sono evolutivi e degenerativi. Nel corso del tempo vengono passo passo coinvolti nuovi sistemi d'organo. Conseguentemente, è raro che persino i disturbi mitocondriali più classici e con un taglio più chiaro, come l'Alpers o la sindrome di Kearns-Sayre , presentino il completo spettro clinico della malattia al momento del primo contatto medico. L'estensione delle manifestazioni cliniche identificate per ogni singola alterazione genetica è abbastanza probabile cambino nel corso del tempo e così vengano identificati meno casi ‘‘classici” . Lo stabilire una diagnosi genetica permette accurati eziologici, pronostici, rischio di ricorrenza, e consigli per la gestione. Nel futuro, è sperabile che questo permetterà anche di realizzare una accurata individuazione di sotto- gruppi all'interno della eterogenea categoria dei pazienti con una malattia mitocondriale in uno sforzo per sviluppare interventi focalizzati per la malattia.

*Questo algoritmo riflette le esaminazioni cliniche attualmente disponibili e l'esperienza del Baylor College of Medicine, Mitochondrial Diagnostics Laboratory.

Fig. 4. Algoritmo clinico per l'esaminazione genetica diagnostica dei geni mtDNA e nDNA attualmente seguito in pazienti con sospetti disturbi mitocondriali nel Baylor College of Medicine, Mitochndrial Diagnostics Laboratory.

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Tecnologie emergenti

Tecnologie basate sul DNA

Sequenziazione del mtDNA con microarray
L'ultimissima versione del microarray per la risequenziazione degli oligonucleotidi della Affymetrix (MitoChip 2.0) fornisce un metodo che produce una sequenza di dati sulla completa regione codificante e 15.452 delle 15.569 bp. del mtDNA ¹²⁸. Esso riduce la possibilità dell'amplificazione dei pseudogeni dalla prima amplificazione del mtDNA nei tre lunghi frammenti sovrapposti che non sono presenti nel nDNA. Inoltre, esso sembra ora essere in grado di rivelare l'eteroplasmia fino a circa il 2–5% ¹²⁹.

Spettrometria di massa ESI-TOF
Ci sono molte piattaforme per la spettrometria di massa idonee per la rapida vagliatura delle porzioni di mtDNA amplificate con la PCR. Queste comprendono la spettrometria di massa con ionizzazione elettrospray e illuminazione temporizzata (ESI-TOF MS), la spettrometria di massa a risonanza ionica ciclotronica e trasformata di Fourier (FTICR-MS) ¹³⁰ e la spettrometria di massa e HPLC a fase inversa di ioni accoppiati e illuminazione temporizzata (ICEMS) ¹³¹. Mentre il costo delle strumentazioni della FTICR-MS mettono questa particolare piattaforma al di fuori della portata di molti laboratori, sia ESITOF-MS che ICEMS sono più economiche e ben-utilizzabili per la rapida sequenza di vagliature e quantificazione della eteroplasmia nella gamma del 1–2%.

Tecnologie basate sulle proteine

Immunocitochimica
Con la disponibilità commerciale di anticorpi monoclonali rivolti a numerose proteine mitocondriali, è ora possibile usare metodi immunocitologici per la diagnosi di difetti OXPHOS selezionati ¹¹⁷. Nella maggioranza dei casi, il successo di questi metodi dipende dalla espressione delle proteine mitocondriali difettose in colture di fibroblasti cutanei. Le immagini diagnostiche sono avvincenti quando questo avviene, come nel caso dei difetti della piruvato deidrogenasi E1a ¹¹⁸. Il retroterra autofluorescente complica l'uso di molte sonde immunofluorescenti nelle biopsie muscolari, ma l'uso di cocktail di anticorpi OXPHOS attentamente selezionati nelle analisi Western immunoblot ¹³² e l'immunocattura di complessi assemblati ¹³³ hanno provato essere potenti tecnologie analitiche.

Proteomica e biologia dei sistemi
L'accurata purificazione dei mitocondri da differenti tessuti, combinata con i metodi al gel e la spettrometria di massa con cromatografia avanzata, ha permesso che venissero caratterizzati numerosi proteomi mitocondriali tessuto-specifici ¹³⁴ e l'importanza fisiologica del poter esaminare le eterogeneità tessuto-specifiche ¹³⁵. Questo lavoro è finemente complementato dallo sviluppo di potenti strumenti bioinformatici da parte di Mootha e colleghi ¹³⁶. Usando un approccio di biologia sistemica, essi hanno sviluppato un programma software addestrabile , il ‘‘Maestro”. Questo usa otto parametri

differenti per stimare la probabilità della localizzazione mitocondriale per identificare 1.451 proteine mitocondriali su 33.860 proteine nel database della totalità delle proteine umane Ensembl con un rapporto di stima di false scoperte attorno al 10% ¹³⁶. Per esempio, l'pplicazione di queste metodi ha portato all'identificazione di MPV17 come una causa delle sindromi da deplezione del mtDNA ¹³⁷ e di LRPPRC come la causa di una forma della sindrome di Leigh ¹³⁸.

Spettroscopia funzionale

Spettroscopia P³¹e¹³C
Più di ogni misura statica, la capacità dinamica delle cellule e dei mitocondri a rispondere e riprendersi dai cambiamenti delle condizioni fisiologiche in tempo reale determina molto bene come stanno e sopravvivono. Uno metodi per la misurazione di questa capacità dinamica in vivo ³¹è la risonanza magnetica spettroscopia del fosforo (³¹P-MRS). Questo metodo permette la misurazione dell'ATP e della fosfocreatina per lo stato basale, l'esercizio, e il recupero che possono rivelare deragliamenti molto sottili della funzione mitocondriale ¹³⁹. Anche la ¹³C-MRS è una tecnologia emergente. Comunque, la bassa abbondanza naturale del ¹³C (circa l'1,1% del ¹²C) crea qualche sfida per il suo uso di routine nella esaminazione clinica del metabolismo ¹⁴⁰. Tuttavia, la sua versatilità nell'arricchire e tracciare studi continua a guidare a nuovi sviluppi nella nostra comprensione delle differenze cellulari specifiche nella funzione mitocondriale ¹⁴¹.

Ottica, biofotonica, e nanotechnologie

Spettroscopia a biocavità laser
Il laser a biocavità è un nanolaser a semiconduttore delle dimensioni di circa una moneta da 1 centesimo. Le cellule o i mitocondri che fluiscono attraverso la biocavità del laser scatenano l'emissione di fotoni di luce laser. La misura della deriva verso il rosso di questa luce laser emessa fornisce informazioni sulla composizione biofisica dei mitocondri sani e malati. Diversamente dai grandi numeri delle misurazioni chimiche, enzimologiche, o polarografiche attualmente necessarie per la diagnosi, il laser a biocavità rappresenta un singolo esame che può misurare lo stato biofisico generale di cellule e mitocondri. Nel primo studio di questa nuova tecnologia nelle malattie umane, la biocavità a laser è stata in grado di rivelare la disfunzione mitocondriale in disturbi vari come il cancro ¹⁴² e la malattia OXPHOS primaria ¹⁴³.

Nanomedicina
I mitocondri hanno l'unica proprietà elettrofisica di concentrare o attrarre anfipatiche, a carica delocalizzata, molecole cationiche e nanoparticelle. Questo permette la razionale progettazione di una varietà di sistemi di trasporto e consegna. Sicuramente, i lembi mitocondriotropici incorporati nei nanoliposomi trasportanti paclitasselli hanno inibito la crescita delle cellule tumorali in un modello di topo, laddove i paclitasselli liberi non hanno avuto nessun effetto ¹⁴⁴. La consegna selettiva del DNA ai mitocondri, dentro le culture celluari, non può essere lontana dal suo superamento ¹⁴⁵.

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Interazioni luce-mitocondri Il proteobatterio alfa proteodosimbionte dal quale derivano i mitocondri è un discendente di un gruppo di batteri fotosintetici ancestrali porpora, non-solfo ¹⁴⁶. Tracce di importanti interazioni luce-mitocondri perdurano tutt'oggi. Per esempio, Otto Warburg è stato il primo a mostrare che dei lampi di luce di specifica lunghezza d'onda poterono essere usati per ristabilire il normale consumo di ossigeno in preparazioni di mitocondri che erano stati inibiti con il monossido di carbonio ¹⁴⁷. Oggi, la lunghezza d'onda specifica nella gamma del rosso e dell'infrarosso (ca. 600–1200 nm) è conosciuta stimolare una ampia serie di processi biologici andanti dall'espansione delle cellule staminali cardiache in culture ¹⁴⁸ all'accelerare la guarigione delle mucositi associate alla chemioterapia ¹⁴⁹. E' stato recentemente riportato il trattamento con un laser a bassa potenza usando una fonte di luce a 808 nm in una potenziale sperimentazione clinica cieca, in pazienti con ictus acuto ¹⁵⁰.		Sommario In una approfondita esaminazione della malattia mitocondriale è possibile e certamente si cerca di ottenere una chiara diagnosi per i singoli pazienti. Questo è necessario per minimizzare il costo di indagini duplicate, correggere la disinformazione nelle famiglie e nei fornitori di cure sanitarie, e fornire accurati pronostici e consigli sul rischio di ricorrenza. Riconosciuti centri diagnostici mitocondriali lavoranti in stretta collaborazione con clinici di riferimento possono navigare con pieno successo nelle complessità della esaminazione diagnostica e lavorare avanti nello sviluppo di programmi di valutazione di qualità nelle indagini basate su laboratori della malattia mitocondriale. Riconoscimenti Gli autori ringraziano i dottori Salvatore DiMauro, Wolfgang Sperl, e Jan Smeitink per i loro utili commenti a questo manoscritto.
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Cita prego questo articolo di stampa come: R.H. Haas ed al., The in-depth esaminazione of sospetta malattia mitocondriale, Mol. Genet. Metab.

(2008), doi:10.1016/j.ymgme.2007.11.018

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